头戴式微型双光子显微镜MINI2P：记录小鼠自由移动时大脑内不同深度数千个神经元的活动！

　　

Mini2P是一种开源的头戴式微型双光子显微镜，可用于对自由移动小鼠的大脑中成千上万个神经元进行快速、高分辨率、多平面的钙成像。这种新版的微型脑显微探测器重量低至仅2.4克，连接线设计高度灵活，让你能够实时观察到“头顶着显微镜的小鼠”在多种环境和行为测试中自由移动时大脑内不同深度的上千个神经元如何互动！即使是在小鼠攀登、跳跃和因威胁而逃跑等剧烈行为期间，运动伪影也一样很小。Mini2P分辨率高、能保持成像稳定，可以在几周时间内对同一簇神经元采集数据来进行长期行为研究。

别看才不到3克，Mini2P的创新之处不仅在于具有扩大的视场(FOV)、更在于增加了具有z扫描范围和速度的微型可调透镜，可通过静态电压在不引起升温的情况下操纵镜头的曲率，允许对多个交错平面进行快速和稳定的成像，以及3D功能成像。借助双光子激发的光学断层能力，MINI2P能以高信噪比进行钙成像，而不受体细胞或神经纤维层密度、神经元活性水平的影响。

通过多个相邻FOV连续成像，可使观察细胞数量提高到10,000多个神经元，也可以在数周时间内对同一簇神经元采集数据来进行长期行为研究。通过增加定制设计的μTlens—— 一种减轻重量、加快聚焦速度的z-扫描设备，可以从不同深度的多个相邻平面记录神经元活动，扩展了z平面的成像能力。实验结果表明，借助Mini2P可从小鼠大脑中视觉皮层、内嗅皮层和海马的不同深度的细胞群中获得大规模的原理验证数据，揭示各区域的细胞空间调节。

亮点：

• 在广泛的行为范围内观察到稳定的高质量成像
• 监测数以千计的视觉或内嗅皮层细胞的活动，
• 可定制设计z-扫描模块，跨多个平面快速成像

Mini2P是由挪威科技大学Kavli系统神经科学研究所开发的，他们于2022年3月在《Cell》发表的文章中详细介绍了Mini2P的实验结果。野生型小鼠通过注射AAV1-syn-GCaMP7f，获得能在CaMKII启动子控制下广泛表达GCaMP6s的转基因小鼠 (Camk2a-tTA;tetO-GCaMP6s)，这是一种在动作电位期间与钙离子结合并发出荧光信号响应的蛋白质，因而能够用MINI2P的红外激光来捕捉记录神经元的活动信号。

在文章中，研究人员以观察大脑中三个不同深度、需要不同光学路径的区域——水平方向的浅层视皮层(VC)区域，需要用三棱镜的垂直方向的内侧内嗅皮层(MEC-PAS)区域，需要借助GRIN透镜的更深层的海马区(CA1)区域——应用MINI2P的案例，来证明了MINI2P的适用性。

他们证明V1和邻近视觉区域中存在多个空间调节细胞类别，并通过多个相邻FOV连续成像使观察细胞数量提高到10,000多个神经元；在海马和内嗅皮质中发现了具有与位置细胞和头向细胞相似特性的细胞。在较难接近的近垂直方向MEC- PAS区域，他们通过1.3x 1.3 x1.6 mm3的棱镜监测了数百个网格细胞的活动，失真最小，分辨率高到MEC表面以下数百μm。这种能在小鼠不受限制地行动中同时记录数百个急剧调整的网格细胞的能力，为MEC的功能研究铺平了道路。MINI2P与GRIN透镜结合使用在深层结构如CA1区域，研究记录了超过100个活跃的定位/位置细胞（place cell）。虽然记录的细胞数量并未超过1P显微镜，但能够更忠实地重建那些密集活跃相邻的CA1细胞发出的信号。他们还尝试在五周的时间内四次记录了同一批视觉皮层神经元，即使期间设备经过分离和重新连接，它们也能够匹配36% 的细胞。

文章的资深作者Edvard Moser表示，“Mini2P是第一种允许我们在自然行为的动物中高分辨率地研究神经网络活动的工具。”

纽约西奈山伊坎医学院神经科学副教授Denise Cai表示：“这个 MINI2P 系统可能会改变我们领域的游戏规则，”以单细胞分辨率和长时间记录运动小鼠的大量神经元，“将极大地扩展我们可以提出的问题类型，以及我们可以就行为背后的神经回路得出的结论。”

德国波恩大学医学中心小组组长Tobias Rose表示，MINI2P可以在几周内以亚细胞分辨率对相同的神经元簇进行成像，对一些实验很有用。

MINI2P的部分限制在于，1. 受限于目前采用的点扫描机制，增加视野会减少每个神经元的曝光时间，从而降低信噪比和细胞检测能力。在不牺牲成像速度或空间分辨率的情况下，视野几乎不能增加更多。2. 虽然MINI2P在小鼠皮层的浅层表现良好，但散射和吸收可能会降低深层的成像质量。3P激发是一种替代方案，但需要找到能传输1300 nm或1700 nm飞秒激光脉冲的替代光纤。3. 动物的自由活动受到HC-920长度的限制，HC-920的长度目前为2-2.5 m，足以让小鼠在不超过1x 1 m2的盒子中自由活动。小鼠运动并非完全不受限制。没有微型飞秒激光或自由空间激光传输技术的情况下，无线2P显微镜尚不可行。造价太高可能也是另一个限制。

如何购买和使用Mini2P？

MINI2P研讨会涵盖Mini2P的开发、组装、图像采集、镀基以及在自由移动的小鼠中使用微型显微镜的所有方面。研讨会将包括讲座、互动研讨会和演示Mini2P系统构建和组装的实验室课程，目的是教你在你的实验室中建立Mini2P所需的技能。

主题包括：

微型双光子显微镜的最新发展
Mini2P系统搭建，微型镜装配，性能测试
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