新CRISPR工具“激活”而不是“编辑”人类免疫细胞基因

一个研究小组使用了一种名为CRISPRa的方法来激活不同细胞基因组中的每个基因，使他们能够同时测试近2万个基因。这使他们能够快速了解哪些基因提供了最有力的杠杆来重新编程细胞功能的规则，从而最终导致更强大的免疫疗法。

　　

格莱斯顿研究所和加州大学旧金山分校(UCSF)的科学家们说，他们已经利用CRISPR-Cas9系统强制激活——而不是编辑——人类免疫细胞中的基因。研究人员称，这种被称为CRISPRa的方法可以让他们比以前更彻底、更快地发现在免疫细胞生物学中发挥作用的基因。

“这是一个令人兴奋的突破，将加速免疫疗法的研究，”医学博士Alex Marson说，他是这项新研究的资深作者。“这些CRISPRa实验创造了一个罗塞塔石碑（指解决谜题或困难事物的关键线索或工具），有助于理解哪些基因对免疫细胞的每种功能都很重要。反过来，这将使我们对如何改变免疫细胞的基因有新的认识，这样它们就可以成为癌症和自身免疫疾病的治疗方法。”

这项发表在《Science》杂志上的研究，据报道是首次成功地在人类原始细胞中大规模使用CRISPR，这些细胞是直接从个人身上分离出来的。

该团队激活了不同细胞基因组中的每个基因，使他们能够同时测试近2万个基因。这使他们能够快速了解哪些基因提供了最有力的杠杆来重新编程细胞功能的规则，从而最终导致更强大的免疫疗法。

人类T细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对健康的免疫功能至关重要，在自身免疫、免疫缺陷和癌症中可能会失调。系统地理解调控T细胞激活与功能获得和功能丧失基因干扰的调节机制，将为疾病途径提供更多的见解，并为设计下一代免疫疗法提供进一步的机会，”研究者写道。

“尽管CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR干扰(CRISPRi)筛查是在不朽细胞系中进行功能获得和功能丧失研究的强大工具，但在原代细胞类型中大规模部署它们仍具有挑战性。在这项研究中，我们在人类T细胞中开发了CRISPRa和CRISPRi发现平台，并对刺激下细胞因子产生的功能性调节因子进行了全基因组筛选。

“我们优化了慢病毒的方法，使CRISPRa机制能够高效和可扩展地传递到原代人类T细胞。这个平台允许我们进行全基因组的聚合CRISPRa筛选，以发现细胞因子产生的调节因子。根据CD4+ T细胞中内源性白介素-2 (IL-2)的分泌水平或CD8+ T细胞中干扰素-γ (IFN-γ)的分泌水平，荧光激活细胞将受CRISPR干扰的细胞池分为高桶和低桶。其中包括近端T细胞受体(TCR)信号通路基因，表明这些成分的过表达可以克服信号瓶颈，调节刺激和细胞因子的产生。

“用CRISPRi进行的全基因组功能缺失筛查可以检测到关键的调控功能，包括一些被CRISPRa遗漏的功能。相比之下，CRISPRa还识别出可能不需要的命中，在某些情况下，在筛选条件下仅以低水平表达。核因子κB (NF-κB)信号通路调控IFN-γ的产生，其中CRISPRi识别出一个所需的TCR-NF -κB信号通路(包括MALT1和BCL10)。CRISPRa选择性地检测了一组肿瘤坏死因子超家族受体，这些受体也通过NF-kB信号，包括4-1BB、CD27、CD40和OX40。

“在我们的实验条件下，这些受体不是单独的信号转导所必需的，但在过表达时可以促进IFN-γ。因此，CRISPRa和CRISPRi互补，全面发现功能性细胞因子调节因子。

“阵列CRISPRa扰动验证了CD4+和CD8+ T细胞关键命中的效果。我们还通过测量一组分泌的细胞因子和趋化因子，评估了单个CRISPRa扰动如何更广泛地重组IL-2和IFN-γ以外的细胞因子的产生。

“最后，我们开发了一个平台，用于在原代人类T细胞中合并CRISPRa扰动，并结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)读出(CRISPRa Perturb-seq)。我们使用CRISPRa Perturb-seq对70个全基因组屏幕点击引起的单细胞状态进行深度分子表征，并通过控制来揭示细胞因子产生的调节因子是如何调节T细胞激活并使细胞进入不同的刺激反应状态的。

“我们的研究为在人类原代T细胞中大规模汇集CRISPRa和CRISPRi提供了一个强大的平台。配对的CRISPRa和CRISPRi筛选使基因网络的全面功能映射能够调节细胞因子的产生。通过阵列表型分析和聚合scRNA-seq方法对CRISPRa命中进行跟踪，可以对关键屏幕命中进行精确的功能表征，揭示关键扰动如何将T细胞调整到治疗相关状态。未来对原代细胞的CRISPRa和CRISPRi筛查可以识别出改进的下一代细胞疗法的目标。”

近年来，Marson和他的同事已经使用CRISPR的靶向剪子来敲除不同类型的人类免疫细胞的基因，包括调节性T细胞和单核细胞。他们的研究结果已经开始阐明如何改造免疫细胞，使其更有效地对抗感染、炎症或癌症。但他的团队知道，他们仍然遗漏了故事的一部分。

“敲除基因对于了解免疫细胞功能的基本原理很有帮助，但只敲除基因的方法可能会漏掉一些真正关键的基因，”Marson实验室的博士后学者、新论文的共同第一作者Zachary Steinhart博士说。

特别是，敲除一个基因并不能告诉你，如果你让这个基因更加活跃，会发生什么。因此，研究人员转向CRISPRa，即CRISPR激活的缩写。在CRISPRa中，Cas9蛋白被改变，因此它不再能够切割DNA。相反，科学家可以在Cas9上附加一种激活剂——一种分子“开启”开关，这样当它与基因结合时，就会激活它。或者，他们可以在Cas9上附加一个抑制因子——一个“关闭”开关——来关闭基因，从而获得类似于典型的基因敲除方法(称为CRISPRi，即CRISPR干扰)的结果。

定位T细胞基因

T细胞是人体免疫的关键媒介之一;它们不仅针对入侵的病原体，而且还指示其他免疫细胞增加或减少它们对入侵者或癌细胞的反应。这种信息传递是通过细胞因子的产生来实现的。不同类型的T细胞产生不同的细胞因子组合，不同的细胞因子或细胞因子组合对免疫应答有不同的影响。

Marson说，控制T细胞细胞因子，将为在各种不同的疾病环境中重塑整个免疫反应提供新的机会。但研究人员对哪些基因控制哪些细胞因子的确切了解还不完全。

在这项新研究中，Marson、Steinhart和共同第一作者拉尔夫·施密特(Ralf Schmidt)医学博士与他们的同事合作，使CRISPRa和CRISPRi在初级T细胞中高效工作——这是以前从未做过的事情。

“这种将CRISPRa或CRISPRi机制送入细胞的效率提高，对于实现全基因组实验和加速发现至关重要，”Marson解释说。

然后，研究小组利用这些方法激活或灭活了直接从多个健康志愿者身上分离出来的人类T细胞中的近20,000个基因。他们对产生的细胞进行细胞因子产生变化的筛选，并锁定数百个作为关键细胞因子调节因子的基因，包括一些以前从未在敲除筛选中发现的基因。

“我们的工作证明了这项技术在人类T细胞中的精确度和可扩展性，”Schmidt说。“我们很快就学会了可以打开哪些基因来调节某些细胞因子水平的规则。”

更好的T细胞疗法

为了治疗某些类型的癌症，临床医生越来越多地使用CAR-T细胞疗法，在这种疗法中，T细胞从患者体内取出，在实验室中设计成靶向癌细胞，然后再注入。例如，通过改变T细胞的细胞因子的产生来增强T细胞对抗癌症的能力，可以使CAR-T细胞疗法更加有效。

“我们的新数据为我们提供了一份非常丰富的T细胞指导手册，”Marson说。“现在我们有了一种基本的分子语言，我们可以用它来设计一个T细胞，使其具有非常精确的特性。”

Marson的实验室现在正在研究他们筛选出来的一些个体基因，并进一步利用CRISPRa和CRISPRi来发现控制人类免疫细胞其他关键特征的基因。

原文检索：

CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells