癌症生物学研究进展突出，体液样本的生物标志物分析备受关注！

癌症是一类由基因突变以及转录、表观遗传和蛋白质组学的变化引起的多基因疾病，这些变化可以作为早期筛查、诊断和个体化治疗的重要生物标志物。例如，几种已知致癌基因（例如EGFR、HER2、KRAS）和肿瘤抑制基因（例如TP53、PTEN、PI3K）的突变已被用作生物标志物，指导乳腺癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌等疾病的治疗。

下一代测序（NGS）的广泛应用显著地促进了血液、尿液、唾液、胸腔积液和脑脊液（即液体活检）中癌症生物标志物的发现。利用NGS对整个基因组或数千个突变同时进行高效测序，可以作为生物标志物检测和发现的有力工具。

其中，常见的体液样本中检测的肿瘤生物标志物包括游离核酸（cfDNA/cfRNA）、细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）、循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）等。

一、 游离核酸

游离核酸（cfDNA/cfRNA）是循环于体液中而游离于细胞外的核酸，主要是机体内的细胞程序性死亡后裂解所释放出的DNA或者RNA。

• cfDNA（cell free DNA）

cfDNA是体液样本研究领域广泛检测的对象，尤其是游离在体液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞，是恶性肿瘤的特征。外周血中的ctDNA包含了癌基因/抑癌基因的突变、微卫星不稳定、后生遗传学变异等基因变异信息，现阶段主要通过高通量测序技术检测分析这些信息并应用于临床。

• cfRNA（cell free RNA）

cfRNA，是存在于人体循环系统中的一些内源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。

科研人员发现，单纯的ctDNA检测不能全面反映疾病在RNA水平的生物活性，无法明确突变对细胞进程的影响。而RNA水平的检测能明确癌症在特定时间发生的变化，可定期监控疾病的发展及对治疗的反应，并预测身患同一癌症的不同个体将对不同疗法有何反应，因此受到广泛关注。

二、 细胞外囊泡

细胞外囊泡（EV）是细胞在静息或应激状态下释放的各种具有脂质双层膜结构的囊泡总称，主要由外泌体、微囊泡和凋亡小体组成，广泛存在于细胞培养上清以及血液、尿液等体液中，被认为是潜在的生物标志物。

三、 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（CTC），是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞，CTC数目往往很少。

目前对游离核酸（cfDNA、cfRNA）的应用比较成熟。不少研究人员开始同时检测cfDNA与cfRNA两个水平的变化，联合分析提供更全面的临床数据。但是，在开发游离核酸检测项目时，研发人员常面临多种挑战：

1. 游离核酸在外周血中含量较低。
2. 游离核酸稳定性、完整性不足，存在一定程度降解。
3. 建库流程较长，操作繁琐，对实验员素质有更高要求。

对以上困难点，通常考虑从两个方面进行解决：当核酸含量不足时，可以选择一些更好的核酸提取技术，也可以选择低起始量的文库构建方案；对于核酸品质差，降解严重的样本，可以选择兼容低品质核酸的文库构建技术。综合看来，选择能支持微量核酸起始、兼容不同品质核酸的文库构建技术能够一次解决上述所有问题。

Takara适用于cfRNA、cfDNA的NGS解决方案，可以从容面对游离核酸项目研发遇到的多种瓶颈。

cfRNA文库构建

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian（Pico v3）

Pico v3如何解决FFPE、cfRNA样本降解，微量建库的难题：

① Pico v3支持250 pg-10 ng total RNA起始，即使珍贵的微量临床样本，也无需过于担心样本量不足。
② 支持RIN2-10或DV200≥25%的RNA起始，无论是品质较好还是高度降解的cfRNA样本，都能生成优质的文库。
③ 创新性地引入了ZapR Rprobes的核糖体去除技术，无需提前处理rRNA，便可在建库过程中识别、切断核糖体来源的cDNA，最终能在7.5h 内完成链特异性Illumina文库的构建。
④ 通过添加UMI，Pico v3可以灵敏地识别PCR重复片段并校正PCR扩增错误，从而进行正确的样本数据回溯，提供更可靠的RNA-Seq分析。

实验案例

分别使用250 pg -10 ng 的人脑部总RNA制备文库，每个起始量2个技术重复。从下表可以看出不同起始量的情况下，测序数据非常相似。TPM≥0.1的转录本数量超过60,000，并且保留了链来源信息。读段中比对到核糖体cDNA的比例在14%到18%之间，即以250 pg 和10 ng RNA 起始制备的文库具有高度一致性。

Human brain total RNA
Input amount	250  pg		1 ng		5 ng		10 ng
Library Yield (ng/l)	26.5	24.4	18	25.3	55	66.8	45.2	32.7
Number of reads (millions)	12 (paired end reads)
% of reads discarded	1.08	0.93	1.67	0.67	0.86	0.71	0.66	0.79
% unique reads	69.06	66.66	83.99	84.05	89.85	90.37	90.98	90.86
Overall mapping	95.2	88.8	94.8	96.3	96.4	96.6	96.8	96.4
# of transcripts >= 0.1 TPM	61,742	60,496	67804	68620	68775	70865	71130	72677
# of gene >= 0.1 TPM	20,820	20,650	21856	21669	22005	22159	22140	22399
% Strand Specificity	90.1	90.06	89.74	90.52	89.98	90.7	90.09	90.99
Proportions of total reads (%)
exon	35.8	33.7	34.1	36.7	35	36.5	36	37.4
intron	35.5	33.4	34.5	36	35.3	36.6	35.9	36.2
intergenic	4.3	4.1	4.2	4.4	4.3	4.5	4.3	4.5
mapped to rRNA	14.7	13.4	17.4	14.4	17.3	14.1	16.2	14.2
mapped to mitochromosome	4.8	4.2	4.6	4.8	4.5	4.9	4.4	4.1
reads mapped to genome	75.7	71.2	72.8	77.1	74.6	77.7	76.2	78.1

以上数据结果也证明，微量cfRNA起始时， 使用Pico v3可以得到同样高品质的文库。

cfDNA文库构建

虽然cfDNA的应用日趋成熟，但总有一些微量样本无法用传统技术完成高品质文库的构建，特别是在进行肿瘤早期诊断有重要价值的稀有突变分析时。

ThruPLEX Tag-Seq HV Kit

① ThruPLEX Tag-Seq HV试剂盒支持单管、三步操作，手动15 min，全程2 h，过程中无需转管与纯化，实验小白也能轻松上手。
② ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，input volume为30 μl，无需样品浓缩。
③ 搭配UDI建库，ThruPLEX Tag-Seq HV可以有效降低index hopping效应，是高通量型Illumina测序仪的“友好伙伴”。
④ 通过添加UMI，ThruPLEX Tag-Seq HV双端总共可有144种UMI连接到DNA分子两端，足以正确区分是测序错误还是真实的稀有突变。

实验案例

Takara科学家采用ThruPLEX Tag-Seq HV 对10 ng 起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA标准品（AccuRef）构建文库，该ctDNA标准品带有一系列特征化的不同频率（0%，1%，5%）突变位点。文库构建完成后，肿瘤相关的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel进行捕获富集。结果显示，目标区域的捕获高效可靠，10 ng 起始的DNA样本约有79%的reads来自或者接近目标区域。

随后，Takara科学家用UMIs鉴定了ctDNA标准品中特定位点的实际突变频率，结果显示，检测到的突变频率分别与预期1%、5%的等位突变频率接近，而阴性对照组没有在位点处检测到任何突变。

（数据来源于Takara Bio USA, Inc.）

以上结果表明，ThruPLEX Tag-Seq HV文库构建系统，具有流程完整、快速，文库复杂度高，结果可靠性高，兼容困难样本等特点，适用于肿瘤学研究等应用领域。

另外，Takara对产品进行了升级，推出了ThruPLEX Tag-Seq HV PLUS Kit：在ThruPLEX Tag-Seq HV的基础上，整合了ThruPLEX HV PLUS Enzymatic Fragmentation Module的完整文库构建试剂盒。不仅保留了ThruPLEX HV的显著功能，并且无需在文库制备之前进行任何机械打断或单独的酶切片段化处理，从而实现了性能和速度的充分结合。

经过上述的介绍，相信大家已经对液体活检的重要性以及游离核酸的建库方案有了初步认识，也对Takara兼容cfDNA/RNA的SMARTer、ThruPLEX技术有所了解。上述涵盖微量核酸起始、兼容不同品质核酸、操作简便等特点的SMARTer、ThruPLEX技术有望助力相关实验开展或项目研发。

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