做线粒体氧化应激，一台Cytation多模式细胞成像仪就够了？

现在，我们就一起来看看Cytation 5 如何在线粒体研究中展示它的十八般武艺。

BioTek Cytation 5作为一款灵活的模块化设计的细胞成像微孔板检测系统，不仅能够实现多色荧光、明场、高对比度明场和相差成像的检测需求，又同时能够实现基于酶标仪的吸收光、荧光和发光的检测需求。接下来我们就一起来看看Cytation 5 如何在线粒体研究中展示它的十八般武艺。

溶血磷脂酸（LPA）是一种生长因子类脂质介质，通过激活多个LPA G蛋白偶联受体调控多种生理功能。以往的研究表明，LPA通过其3型受体（LPA3）抑制早衰综合征（HGPS）患者成纤维细胞的氧化应激。而线粒体作为氧化应激的主要来源，能够过度产生活性氧（ROS）。另外，线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP，并具有细胞钙缓冲能力，其缺陷会导致抗氧化能力下降和细胞凋亡。那LPA3与线粒体稳态及线粒体氧化应激之间到底存在着什么样的调节机制，目前仍不清楚。

近期，Hsinyu Lee等人在Antioxidants上发表了“Lysophosphatidic Acid Receptor 3 Promotes Mitochondrial Homeostasis against Oxidative Stress: Potential Therapeutic Approaches for Hutchinson–Gilford Progeria Syndrome”的文章，该文章对LPA3信号在线粒体生物发生和氧化应激反应中的重要作用进行了阐述。

首先，为揭示LPA3在调节线粒体活性中的作用及其潜在机制，作者探究了LPA3 siRNA敲除细胞对电子传递链（ETC）复合物抑制剂的响应以及线粒体膜电位Ψm的变化和细胞内ROS积累变化。通过Cytation 5 对细胞进行成像和分析发现，在LPA3 siRNA敲除细胞中，对ETC抑制剂更加敏感，线粒体Ψm有明显的去极化，并且细胞内ROS积累增加（图1）。这些结果表明，LPA3是对抗线粒体应激所必需的。

图1. LPA3缺失细胞线粒体稳态受损。(A)siRNA对照和两个siLPA3 HeLa细胞在线粒体ETC抑制剂抗霉素a和鱼藤酮处理下的细胞活性检测；(B)TMRE染色下的线粒体ΔΨm分析；(C)DCFDA染色分析细胞ROS。

由于线粒体的健康状况与细胞色素c的释放有关，因此，该研究中作者同时监测了细胞色素c的释放，结果发现，LPA3 siRNA敲除后，细胞色素c释放率有明显的增加（图2），进一步强调了LPA3在线粒体内稳态中的重要作用。

图2. LPA3的下调增加了细胞色素c从线粒体向细胞质的释放。(A) siRNA对照(Ctrl)和LPA3 siRNA下调(siLPA3) HeLa细胞免疫荧光染色结果，细胞色素c（绿色）和线粒体标记物HSP60（红色），细胞核（蓝色）。白色箭头表示细胞色素c释放细胞。

由于之前的研究表明，腺嘌呤核苷酸转位酶2（ANT2）的低表达与细胞衰老所固有的线粒体有关，而ANT2作为线粒体稳态的关键调节因子，能够通过线粒体内膜交换ADP和ATP。因此，该研究又进一步探究了LPA3信号通路对ANT2的调节关系以及线粒体ADP-ATP交换活性（图3）。通过Western Blot实验和基于Cytation 5酶标检测的荧光分析发现，siLPA3显著降低了ANT2的蛋白水平，并且，在siRNA敲低LPA3的细胞中ADP-ATP交换表现出显著的衰减，而用LPA3高选择性激动剂OMPT激活后，又能够显著增强Hela细胞和人皮肤成纤维细胞（HSF）中的ANT2蛋白表达和ADP-ATP交换活性。这些结果表明，LPA3信号通路在调节线粒体ADP-ATP交换中起着关键作用。

图3. LPA3调节线粒体ADP-ATP交换活性。(A) LPA3敲低细胞中ANT2蛋白表达分析；(B) siRNA对照(Ctrl)和siLPA3 HeLa细胞的ADP-ATP交换活性分析；(C) LPA3激动剂OMPT处理后的ANT2蛋白表达分析；(D) OMPT处理后ADP-ATP交换活性分析。

结合以上研究，初步证明LPA3在线粒体调节中起着至关重要的作用，那LPA3信号转导是否可能构成一种对抗氧化应激诱导的线粒体功能障碍的新方法呢？为了进一步阐明LPA3在调节线粒体氧化应激反应中的作用，作者对OMPT处理的细胞中线粒体抗氧化剂的蛋白水平进行检测，并通过Cytation 5细胞成像系统对过氧化氢处理细胞的线粒体膜电位进行分析，结果发现，经OMPT处理后，HeLa细胞中抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶1（Gpx1）和超氧化物歧化酶1型和2型（SOD1和SOD2）的蛋白表达水平有明显的提高。并且，在过氧化氢诱导的氧化应激中，线粒体Ψm明显去极化，而在OMPT处理后得到恢复（图5）。同样的实验方法也证实了LPA3的激活能够恢复早衰综合征患者细胞的线粒体活性。

图5. LPA3对氧化应激诱导的线粒体功能障碍有保护作用。(A) LPA3激动剂OMPT处理后，HeLa细胞中Gpx1、SOD1和SOD2蛋白表达分析；(B) TMRE染色分析线粒体膜电位(Ψm)变化。

综合以上结果，表明LPA3对氧化应激诱导的线粒体功能障碍有保护作用，增强LPA3信号通路可能是一种对抗衰老进程和线粒体氧化应激的新途径。而该研究结果，对衰老过程中导致线粒体稳态的分子机制的理解，以及针对这些病理条件的新干预策略的发现具有非常重要的指导意义。

发现了吗？BioTek Cytation 5 几乎贯穿了整篇文章！作者多次采用BioTek Cytation 5的活细胞多色荧光成像模块用于细胞增殖、细胞ROS和线粒体膜电位的检测，并得到了高质量的图片和数据结果。并通过Cytation 5的酶标模块进行了线粒体ADP-ATP交换活性分析。Hybrid 是Cytation 的灵魂，将倒置荧光显微成像系统与多功能酶标的整合，使用户可以在一次细胞实验中进行联合分析获得多参数多维度的检测结果。因为两套系统完全独立，除了联合分析以外，两套系统也可以独立使用，互不干扰，占用更少的空间来满足实验室更多的应用和需求。

基因有限公司作为BioTek在中国的合作伙伴，致力于为您提供更加完备的多功能微孔板检测和成像设备。邀您一同关注我们的官方微信“基因快讯”，如需要了解更多产品信息，可留言或者直接联系基因有限公司各地办事处。