基于微流控技术的快速治疗性抗体发现新方法

【字体: 时间:2022年03月31日 来源:基因有限公司

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  Merk Healthcare等首次使用英国Sphere Fluidics公司的商品化微流控单细胞分析筛选平台Cyto-Mine进行了3个不同的实验。

近年来,微流控技术应用于抗体发现取得了空前的发展。使用微流控技术可以用于天然配对链文库的产生,从免疫的啮齿类动物或者人外周血中直接筛选获得特异性抗体分泌的细胞。Merk Healthcare等首次使用英国Sphere Fluidics公司的商品化微流控单细胞分析筛选平台Cyto-Mine用于:01.从啮齿类动物以及人浆细胞中进行天然配对链抗体的鉴定;02.与重组抗原特异性结合抗体筛选实验;03.基于TCR细胞活化进行功能性浆细胞或杂交瘤细胞的筛选。从细胞制备到重组抗体的验证只需4周。该方法可以加快治疗性抗体药物发现进程。

在该项研究中,作者Ramona等使用Cyto-Mine微流控单细胞分析筛选平台共进行了3个不同的实验。

一、 使用Cyto-Mine进行特异性抗体发现


Figure1. Cyto-Mine抗体发现流程。

从经过免疫的啮齿类动物或接种疫苗的人浆细胞中可获得Antibody-secreting cells(ASC)即抗体分泌细胞。进行浆细胞富集后,在Cyto-Mine平台上进行上样、包裹产生微滴、根据特异性抗体分泌或功能进行分选、单细胞分配至微孔板。(如Figure1.所示)

随后在4-6周内完成抗体gene recovery和亚克隆,重组质粒表达以及细胞功能的特异性结合、亲和力等抗体特性的验证。(如Figure1.所示)

该实验中用到的小鼠浆细胞(来自于免疫了cancer related antigen(CRA)即癌症相关抗原的小鼠骨髓、淋巴结、脾脏)以及人浆细胞(来自于接种了tetanus toxoid (TT)即破伤风类毒素疫苗的健康捐献者外周血)均分别进行了CD138和CD38阳性富集。1百万个细胞重悬在1mL培养基以及检测试剂后上样至Cyto-Cartridge,包裹产生含有单细胞的微滴,37°孵育2-18小时后,在Cyto-Mine平台上进行基于FRET荧光信号分选。分泌人破伤风类毒素抗体的细胞以及表达小鼠癌症相关抗原抗体的细胞分别分配至96孔板。后续进行单细胞mAb gene recovery和subcloning。纯化后的质粒转染至Expi293F 细胞中进行表达,对培养上清进行人破伤风类毒素抗体以及小鼠癌症相关抗原抗体的特异性和亲和力测试。

[注]: 人破伤风类毒素抗体实验FRET探针对设计为:AF488 labeled TT-CTD和Goat F(ab’)2 Anti-Human IgG–(Fab’) 2 (DyLight® 594) ;小鼠癌症相关抗原抗体实验FRET探针对设计为:biotinylated CRA , Streptavidin-AF488和Goat F(ab’)2 Anti-Mouse IgG – (Fab’)2 (DyLight® 594) 。

Table 1. Cyto-Mine用于人破伤风类毒素抗体以及小鼠癌症相关抗原抗体发现统计学结果

1.人破伤风类毒素抗体发现结果:

新鲜制备的CD38阳性人浆细胞包裹形成200万个单细胞微滴,冻存5天后的CD38阳性人浆细胞包裹形成100万个单细胞微滴,经Cyto-Mine FRET分析、分选,分别分配了316个以及117个微滴至微孔板,经full mAb PCR recovery、亚克隆以及重组质粒表达和特异性、亲和力测试后,共筛选到一组44个序列多样性以及高亲和力的全人破伤风类毒素抗体panel。Hit rate为10%。

2.小鼠癌症相关抗原抗体发现结果:

新鲜制备的以及冻存2个月的CD138阳性小鼠浆细胞分别包裹形成200万个微滴,经Cyto-Mine FRET分析、分选,分别分配了635个以及96个微滴至微孔板,经Full mAb PCR recovery、亚克隆以及重组质粒表达和特异性、亲和力测试后,共筛选到一组30个序列多样性以及高亲和力的小鼠癌症相关抗原抗体panel。(冻存2个月的小鼠浆细胞来源的33个PCR扩增产物未继续进行下游实验)

二、 使用Cyto-Mine基于细胞结合实验进行ASC筛选

表达anti-human EGFR抗体的mAb108杂交瘤细胞与不相关的表达anti-CD3抗体的OKT杂交瘤细胞以1:100比例混合,与表达EGFR的A431细胞共包裹。经ELISpot检测,其中表达anti-human EGFR抗体的mAb108杂交瘤细胞占比约30%,在混合的杂交瘤细胞群中占比约0.3%。使用tandem-dye-labeled pan-B-cell 染料对杂交瘤细胞进行标记,即可通过488nm激发后检测最强的红色荧光通道信号作为杂交瘤细胞的判断标准。通过anti-Fc -488检测细胞之间的结合,检测绿色荧光通道下最强的荧光信号。分配了288个包含多于1个细胞的微滴至微孔板,对241个微滴进行了轻链特异性PCR,其中有77个微滴中特异性包含mAb108,有179个微滴中特异性包含OKT3,15个微滴中共包裹了mAb108和OKT3。该实验将表达anti-human EGFR抗体的mAb108杂交瘤细胞从0.3%富集到了32%。因此,使用预先标记的ASC细胞,基于细胞结合实验,可以对特异性表达某种抗体的ASC细胞进行有效的分选和富集。

a图显示除OKT3杂交瘤细胞之外的所有试剂的分选图,作为阴性对照。b图显示mAb108和OKT3以1:1比例混合的分选图,作为阳性对照。c图显示mAb108和OKT3以1:100比例混合的分选图。d图显示mAb108和OKT3以1:100比例混合的分配图。绿色代表mAb108杂交瘤,红色代表OKT3杂交瘤。可将mAb108杂交瘤由0.3%富集到32%。

三、 使用Cyto-Mine进行功能性抗体筛选

基于浆细胞与reporter cells之间的互作,从而筛选出具有功能的浆细胞是众多抗体发现研究人员迫切需要实现的抗体开发方式。较于单纯的特异性抗体筛选实验来说,可以进一步通过功能的验证分选富集到功能性浆细胞,使得抗体发现先人一步。

将表达anti-CD3抗体的OKT杂交瘤细胞与表达anti-human EGFR抗体的mAb108杂交瘤细胞以1:100比例混合,这两种细胞均经过了CellTrackerTM Orange染色,可在红色荧光通道下检测荧光信号。表达anti-CD3抗体的OKT杂交瘤细胞占比约0.5556%。将该混合细胞群与Jurkat-GFP reporter cells共包裹,通过筛选CD3激动功能诱导的Jurkat细胞GFP的表达进行功能性OKT杂交瘤细胞的筛选。共计分配了1936个微滴至微孔板,192个微滴进行了PCR分析,其中有130个扩增出了OKT3特异性的VK区域,相当于68%的hit rate(PCR recovery rate 77%)以及88%的富集率。

a图为0h ASC细胞以及reporter cells的信号。b图为8h孵育后,分选reporter cell的信号。c图为分配图。在6.6%分选的事件中圈门设定12%的事件,相当于0.55%的预期阳性率。灰色显示的微滴不做评估,红色显示的微滴为确认的包含OKT3的微滴,浅蓝色显示的微滴进行分配。d图显示单细胞基因PCR产物凝胶电泳图示例。最上面一排指示OKT3 和mAb108抗体基因的VH区域;中间一排指示OKT3 VK区域特异性扩增产物;最下面一排指示mAb108VK区域特异性扩增产物。

综上所述,英国Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine微流控单细胞分析筛选平台:

  • 功能多样化:1) 可在1天内筛选得到特异性抗体分泌的浆细胞;2) 共包裹两种或以上的细胞基于细胞结合进行表达特异性重组蛋白抗体的细胞分选;3) 共包裹两种或以上的细胞基于TCR细胞活化进行功能性浆细胞或杂交瘤细胞的筛选。
  • 自动化:整个实验流程自动化、标准化,分配至微孔板中的目的细胞可直接进行单细胞PCR、单细胞测序等进行抗体基因recovery、重组质粒表达以及特异性、亲和力以及功能性的测试。
  • 快速:所有的工作最快在4周左右的时间即可完成。改善了抗体发现的实验流程,大大加快了抗体发现的步伐。

参考文献:Ramona et al. Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery. MABS
.2021, VOL. 13, NO. 1, e1978130

基因有限公司是英国Sphere Fluidics在中国区域推广和销售的合作伙伴,在全国17个城市均有驻当地的办事处。可为您提供售前产品咨询与技术交流、售后安装、应用培训等优质服务。如果想了解更多关于Cyto-Mine的介绍,欢迎点击下方链接进行参阅。或者您也可以直接添加产品经理企业微信进行一对一沟通。

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