Nat Biotech：只需8小时，超快速纳米孔测序当天确定致病变异

　　

斯坦福大学领导的研究团队近日展示了快速全基因组测序在危重病诊断中的价值。他们开发出一种超快速的纳米孔测序流程，可在8小时内获得遗传病的线索，而过去往往需要数天。

研究人员基于Oxford Nanopore公司的高通量测序设备PromethION 48开发出该流程，并结合优化的样本制备方案、48张测序芯片上的并行测序，以及快速的数据分析，有望帮助医生快速诊断危重病患者。这项成果于3月28日发表在《Nature Biotechnology》杂志上。

此次有12名年龄在3个月到57岁不等的重症患者参与了研究，他们都患有危重病，但医生束手无策，无法判断病因。斯坦福大学医学院著名教授Euan A. Ashley领导的团队与Oxford Nanopore、英伟达和谷歌等公司合作，希望缩短人类全基因组测序的时间。

对于所有参与者，超快速的测序和分析流程在一天内完成，其中5名患者确定了致病性的遗传变异。这表明诊断率达到42%。研究人员认为，快速鉴定致病变异可为临床管理提供指导，也有望改善预后并降低治疗成本。

超快速的测序流程

全基因组测序在医疗诊断方面很有优势，但测序和下游分析的流程往往很慢。2015年，测序加诊断最快需要26小时。近两年，这个时间进一步缩短到十几小时。当然，研究人员还面临一系列问题，比如传统的样本制备方案无法从有限的血液中生成文库，这一点在分析危重新生儿时显得尤其重要。此外，数据生成的速度远远超过了碱基检出和比对的速度。

为此，Ashley领导的研究团队开发出一个全基因组纳米孔测序流程，它改进了文库制备，采用云端模块来开展近乎实时的碱基检出和比对，并实现了快速变异检出（包括SNP、indel和SV）和重点变异过滤。

研究人员此次采用了Oxford Nanopore的高通量测序设备PromethION 48来开展全基因组测序工作。在验证工作中，他们测序了NIST参照材料HG002基因组。他们在48张测序芯片上并行测序单个样本，并在短短两小时内获得了完整的人类基因组序列。

他们发现，无论是否使用条形码，小片段变异的检出性能都是相似的，而结构变异也能观察到类似的结果。根据这些数据，团队选择不使用条形码，于是文库制备时间缩短了37分钟，并提高了下游测序效率。

同时，测序速度也没有影响变异检出的准确性。结果显示，将HG002用于基准测试时，SNP的F1分数为0.9974，indel的F1分数为0.7322。他们平均在每个样本中发现了449万个小片段变异和22个优先分析的结构变异。

研究团队通过开发云计算架构（谷歌云平台）和跨多个GPU的并行碱基检出和比对（英伟达GPU）来解决数据分析的问题。利用这些方法对深度覆盖的基因组（200 Gb）进行分析，他们近乎实时地获得了长读长的人类全基因组。

临床环境下的应用

为了说明该流程在现实环境中的表现，研究人员具体讨论了两例患者。第一例是一名57岁的男性，存在许多健康问题，包括甲亢、高血压、重症COVID-19，并需要双侧肺移植。心脏磁共振图像提供了肥厚型心肌病的证据，但鉴别诊断的范围很广，需要快速分子检测来明确诊断。

研究人员在不到7小时的时间内完成了变异检出，发现了431万个小片段变异和3.58万个结构变异。之后，他们在TNNT2基因中鉴定出一个诊断性杂合变异，并根据ACMG指南将其分类为可能致病的变异，从而减少了后续多次检测和心脏活检的需求。整个过程耗时7小时18分。

第二例患者是一名14个月大的女婴，她患有肌张力障碍性姿势和发育迟缓，在经历心脏骤停和呼吸衰竭后被送往儿科重症监护室。在抽血后7小时，他们获得了448万个小片段变异和3.64万个结构变异。过滤后将31个小变异和21个结构变异优先交给人工审核。之后，他们在LZTR1基因中发现了一个意义不明的候选变异。

对于这个病例，获得200 Gb测序数据的时间为2小时46分。Oxford Nanopore的CEO Gordon Sanghera评论道：“2.5小时、60倍覆盖度相当于人类全基因组测序只需2.5分钟。我们相信我们可以简化这一过程，将时间缩短一半。这项工作说明了快速的基因组测序有望从根本上改变重症医护的未来。”

“我们很高兴看到这项关键工作的发表，并展示了超快速纳米孔测序对危重病患者的潜在影响。与可能需要数周时间的标准诊断方法相比，这项研究为临床医生提供了准确的信息，以便他们做出决策，并能在当天为患者及其家属提供答案，”他说。

研究参与者、斯坦福大学的John Gorzynski博士在社交媒体上写道：“利用全基因组测序快速诊断危重病患者是很有挑战性的，但我们找到了解决方案！”

这种超快速方法（包括DNA提取、文库制备、测序和数据分析）的成本估计略高于5000美元，其中包括1600美元的测序芯片、1584美元的纳米孔测序试剂以及568美元的分析成本。Oxford Nanopore公司预计，随着样本制备、计算和测序芯片的改进，这些成本将大大降低。

原文检索

Goenka, S.D., Gorzynski, J.E., Shafin, K. et al. Accelerated identification of disease-causing variants with ultra-rapid nanopore genome sequencing. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01221-5