Nature发布一种新型Cas9酶，脱靶效应减少但效率不变

研究团队开发出一种称为SuperFi-Cas9的酶。它能像野生型Cas9一样高效切割正确的靶点，但不大可能切割错误的靶点。

　　

德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员近日开发出一种新版本的Cas9酶。这种酶在用于基因组编辑时不大可能产生脱靶切割，但仍能像野生型Cas9酶一样快速发挥作用。

科学家一直希望将CRISPR-Cas9基因组编辑技术应用于临床，但挑战在于Cas9存在脱靶切割的可能性，这也许会诱导新的突变，而不是修复现有的突变。其他形式的Cas9酶也被陆续开发出来，以提高编辑的准确性。

不过，德克萨斯大学奥斯汀分校的Kenneth Johnson等人认为，这些调整在很大程度上是以牺牲效率为代价的。他们利用冷冻电镜分析了Cas9在不同错配切割阶段的结构。他们发现了一种结构特征，让与Cas9错配的DNA复合物变得稳定，方便酶发挥切割作用。

于是，研究团队重新设计了这种稳定特征，产生了一种称为SuperFi-Cas9的酶。它能像野生型Cas9一样高效切割正确的靶点，但不大可能切割错误的靶点。这项研究成果于3月2日发表在《Nature》杂志上。

研究人员表示，这些结果有助于人们了解控制Cas9脱靶效应的潜在结构机制，同时也为设计 新一代的高保真Cas9变体提供了分子蓝图。新一代变体有望减少脱靶效应，并有效切割目标DNA。

Kenneth Johnson教授及其同事利用冷冻电镜（cryo-EM）观察了Cas9在切割过程中与错配DNA形成的复合物结构。他们首先关注的是Cas9与距离PAM序列12-14 bp的错配之间的相互作用。在此类样本中，Cas9会发生激活，但切割速度比平时慢。

具体来说，他们在样本中发现了两种不同的Cas9构象。线性的双链构象主要出现在切割时间短的初始样本中，而这种构象再加经典的扭结双链构象会出现在切割时间较长的样本中。基于此，他们怀疑线性双链构象代表了HNH核酸酶结构域出现之前的早期中间体。

研究人员之后进一步分析了Cas9与距离PAM序列18-20 bp的错配之间的相互作用，这些错配通常更容易容忍。利用冷冻电镜，他们再次发现线性和扭结构象均存在。而且，RuvC结构域中的一个环发生了结构改变，似乎能够在错配存在的情况下稳定相互作用并激活Cas9。

共同第一作者、德克萨斯大学奥斯汀分校的博士后Jack Bravo打了个比方：“这就像你有一把椅子，其中的一条腿断了，但你用胶布把它绑好。虽然还是可以作为椅子，但不大稳固。这是一种拙劣的修复。”

研究团队在此基础上提出了一种设计Cas9酶的新方法。对于全新的SuperFi-Cas9，所有七个稳定残基都突变为天冬氨酸。他们报告称，SuperFi-Cas9切割目标DNA的速度与野生型Cas9相似，但切割DNA错配的速度要慢500倍。

研究人员指出，他们目前只在试管中完成了SuperFi-Cas9的测试，下一步计划与其他人合作在活细胞中进行测试。

原文检索

Bravo, J.P.K., Liu, MS., Hibshman, G.N. et al. Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9. Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04470-1