为您奉上一套单细胞转录组学研究方案

【字体: 时间:2022年03月05日 来源:基因有限公司

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  单细胞RNA Seq即单细胞转录组测序,是在单细胞水平上对转录事件进行分析的技术,可以研究单个细胞内的基因表达及可变剪切。

单细胞转录组学

单细胞RNA Seq即单细胞转录组测序,是在单细胞水平上对转录事件进行分析的技术,可以研究单个细胞内的基因表达及可变剪切。NGS是单细胞转录组分析的重要技术基础,NEB已经有单细胞转录组测序的完整方案,即合成单个细胞全长cDNA,并对cDNA进行NGS建库用于NGS转录组测序。但受限于二代测序读长短的问题,转录的可变剪接不能很好的解析。整合全长cDNA的PacBio SMRT建库并进行SMRT测序,单细胞Iso-Seq(scIso-Seq)为解析单个细胞基因转录的可变剪切提供了技术支撑。

Iain C Macaulay等在2015年发表在Nature methods的题为“G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes”的文中,利用单细胞挑选结合单细胞Iso-Seq的方法解析了基因融合,验证了在乳腺癌细胞中发现的一种与癌症有关的染色体融合,并鉴定了发生融合的具体位点。该技术有助于更深入的理解正常组织和疾病组织之间的遗传学差异,为人们提供正常发育和疾病发展的新线索,例如可以通过G&T-seq更好的理解肿瘤细胞多样性。

乳腺癌细胞中的染色体融合:

通过单细胞的PacBio全长转录本测序技术Iso-Seq,验证了来自乳腺癌细胞中的全长融合转录本MTAPPCDH7,该融合转录本由MTAP的1-6号外显子与PCDH7的3、4 、6号外显子连接融合组成。

除单细胞转录组学外,挑选特异单细胞后结合一步法RT-qPCR也是比较常用的低成本的单细胞转录学研究技术。Lapin等于2017年在BMC Cancer上面发表的“Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells”一文中使用MMI CellEctor自动化单细胞挑选系统结合一步法RT-qPCR技术分析单细胞基因表达,确定了CTC不同的亚群,并揭示了与CTC向远端器官部位转移相关的转录本表达升高。

胰腺癌CTC单细胞挑选及基因表达分析流程:

1.收集21位胰腺癌病人化疗前后多个时间点血样。
2.利用Lymphoprep™密度梯度离心法得到单核细胞,采用磁珠阴性筛选的方法去除表达CD45, CD16, CD19, CD163和 CD235a/GYPA的淋巴细胞。
3.对可能的CTC细胞进行荧光染色Hoechst 33342、 antibodies EpCAM-FITC、MCAM-FITC和CD45 DyLight550。
4.利用MMI CellEctor可视化自动挑选单个CTC细胞。
5.单细胞RT-qPCR分析CTC细胞EpCAM、CDH2、 CD24等13个基因的转录表达。

CellEctor挑选出单个胰腺癌CTC:

如上图所示,用MMI CellEctor可视化自动挑选出细胞核(Hoechst 33342)可见,以及肿瘤生物标志物(EpCAM-MCAM)阳性和CD45阴性的细胞进行下游分析。

采用单细胞多重RT-PCR对单个CTC中13个生物标志物(上皮EpCAM标记 、间充质EMT标记以及CSC标记等)的mRNA表达情况进行分析。

通过聚类分析确定胰腺癌CTCs存在上皮样和间充质样两个亚群。CTC-E细胞markerCD24高表达, CTC-M细胞外间质蛋白SPARC(胰腺癌基因)高表达。这些转录本的差异影响CTC细胞的亚型,很可能与胰腺肿瘤细胞的转移相关。

单细胞转录组学研究方案

单细胞转录组学配套设备

MMI CellEctor单细胞挑选系统

系统特点
▪ 高精度泵控制毛细管
▪ 自动吸取单个细胞
▪ 细胞活性好,可再培养
▪ 适用于CTC、干细胞等稀有罕见细胞的挑选

PacBio单分子实时测序系统

系统特点
▪ 提供高精准的转录本全长序列
▪ 高精准长读长reads助力基因组各种变异分析
▪ 简单的建库流程
▪ 减少数据分析时间

参考文献:

1. Iain C Macaulay.et al.G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.Nature methods 12.6 (2015): 519-522;
2. Lapin et al. Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells. BMC Cancer (2017) 17:390.

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