利用高通量空间基因组学揭示杂乱无章的染色体信息

【字体: 时间:2022年03月07日 来源:Twist Bioscience

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  基因组规模的荧光原位杂交方法助力解开基因组中令人困惑的谜团

与其说我们的基因组是由 A、G、C、T 构成的整齐的线性序列,倒不如说它更像一碗意大利面:一堆 DNA 杂乱交织。或者说,这至少是在荧光原位杂交(FISH)出现之前我们对它的看法,其中 FISH 方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸标记基因组 DNA。

正如细胞不是简单的“酶袋子”,细胞核也不是一碗“染色体意大利面”。基因组具有非随机的三维组织,决定了基因的表达方式和表达时间。

像 FISH 这样的工具使研究人员能够通过越来越多的细节准确定位特定 DNA 序列在三维空间中的位置,使研究人员现在可以在纳米级分辨率下研究整个基因组。有了这些基因组信息,研究人员就可以开始回答仅凭 DNA 测序无法回答的紧迫问题,例如不同物种之间染色体进化有何不同,以及染色体结构如何影响发育和疾病中的基因调控。

成像技术和合成生物学的进步推动了空间基因组学的兴起。具体而言,DNA 大规模合成的进展起到了催化作用,使研究的重点从数十个位点扩展到数千个位点。

什么是空间基因组学?

空间基因组学是指对基因组三维结构的研究。它跨越了染色体的层次组织,从环到拓扑相关结构域,然后到区室,再到疆域。但是,如果说目前的间接方法(即染色质捕获)提供了这些结构的大致概览,那么像 FISH 这样的直接可视化方法可以在单细胞水平研究它们,从而能够分析这些结构在细胞类型甚至细胞状态之间的差异。在基因组规模下开展这些研究可以揭示局部变化如何影响整个基因组的结构和功能——无论是正常的遗传变异,癌症中的染色体重排,还是病毒将其基因组插入宿主基因组。

空间基因组学可以揭示整个基因组的结构和功能

最近的一个例子是,研究发现与 1 型糖尿病相关的遗传变异可能导致染色质错误折叠,使疾病相关的增强子和启动子聚集在一起形成“超连接团”,并导致疾病相关基因的异常表达1。尽管研究人员最初使用了染色质捕获来了解这些基因组结构,但通过 FISH“绘制”的图片明确证实了基因组结构在异常基因表达和疾病表型中的作用。

对基因组结构与功能关系的更深入理解也可能为合成生物学提供有用信息。如果内源性基因的表达由其空间定位控制(无论局部染色质环境是开放的还是封闭的,或者那些远端元件在附近成环),那么合成基因的表达也是如此。空间基因组学的研究进展可以为合理设计理想的合成基因整合位点提供指导,且有助于构建外源基因和通路表达更稳定或可预测的细胞系。

Oligopaint 推动高通量革命

从最基础的层面上来说,DNA FISH 流程涉及将荧光标记的 DNA 片段杂交到样品 DNA 上,以便使用荧光显微镜直接观察。因此,荧光显微镜可使用的荧光通道数量(4 或 5 个)阻碍了该技术最初的多色迭代。

科学家们已经开发了两种主要方法来克服这一局限。从概念上来说,更简单的方法是顺序成像,即同一样品连续多轮杂交和成像。这种方法属于线性扩展,在一次实验中,通过四个彩色通道和六轮成像只能分辨 24 (4 * 6) 个不同的靶标。

要从数十个靶标扩展到数百或数千个靶标需要使用组合条形码。对一个靶标进行连续多次检测,每次都使用新的荧光标签。然后,研究人员可以用一种颜色靶向多个位点。在单个图像中不可能将一个基因与另一个基因区分开来。然而,在多轮成像过程中,与靶标杂交的一系列独特的颜色汇聚在一起,形成了每个基因位点的识别条形码。

图 1:组合条形码。上图展示了组合条形码的工作原理。通过连续几轮成像可以区分各个位点,每一轮都有机会通过各种方法改变荧光标签。大多数情况下,靶向模板链的探针被设计成带有冗余序列(overhanging stretches)的单链 DNA 片段。然后,使用荧光标记的探针靶向这些冗余序列、成像、然后再解离,为后续的多轮实验腾出空间,每一轮都使用一组新的荧光标记探针。请注意,没有颜色(以白色圆圈表示)也可以用作条形码的一部分。高质量、大规模的寡核苷酸合成使得这项技术可应用于全基因组,从而实现高通量空间基因组学研究。通过 BioRender.com 创建。

研究人员可以使用组合条形码为每个靶标设计条形码,并合成相应的杂交探针。这种方法可实现指数级扩展:在一次实验中,仅通过两个彩色通道和八轮成像就能分辨 256 (28) 个不同的靶标。DNA MERFISH 和 DNA seqFISH+ 都是这种方法的最新应用。

成本是 DNA MERFISH 和 DNA seqFISH+ 等组合方法面临的一大挑战,随着靶标数量的增加,独特检测探针的数量也会增加,因而成本也随之增加。新的原位测序方法通过选择边合成边测序、边连接边测序和边杂交边测序等方法从条形码探针读取空间信息,从而克服了规模化的成本。作为一套名为 OligoFISSEQ (Oligonucleotide Fluorescent In Situ Sequencing,寡核苷酸荧光原位测序)的空间基因组学工具的一部分,无论有多少靶标可视化,这些策略都能使用相同的通用标记探针池来读取基因组靶标位置。

利用合成 DNA 绘图

合成 DNA(特别是芯片合成 DNA)技术的进步,使 DNA MERFISH、DNA seqFISH+ 和 OligoFISSEQ 成为可能。

在大规模平行 DNA 合成出现之前,FISH 探针要么是柱合成的DNA生成,要么是通过随机 PCR 扩增或片段化获得基于克隆的 DNA(基因组 DNA、BAC 载体等)生成。而基于克隆的 DNA容易出错,并且受到重复序列的限制,导致脱靶率高,阻碍了它们在全基因组成像中的应用。

基于柱的 DNA 合成使研究人员能够利用更短、更有效的探针准确地靶向基因组。相比于较长的基于克隆的探针,较短的柱合成探针能更好地结合其基因组靶标,从而减少探针间的相互干扰并实现超分辨率成像。然而,柱合成探针的成本限制了其规模化应用。直到 2011 年芯片制造商生成了第一个 FISH 探针库,才能以可承受的价格实现相关性能和规模。

DNA 合成技术在过去十年中发展迅速。Twist Bioscience 的硅基 DNA 合成平台可以以每个芯片高达 100 万个寡核苷酸和每个寡核苷酸高达 300 个碱基的长度合成 DNA。对于组合条形码和原位测序方法,每个基因组靶标需要数十至数千个约 150 bp 的寡核苷酸探针,以提供高分辨率空间基因组学所需的覆盖范围和分辨率。

探针合成精度和均一性也是实验成功的关键因素。精度可确保探针与其靶标特异性结合,并能够选择性地靶向剪接变体或单核苷酸多态性。均一性保证了探针之间一致的表达,尽可能减少探针浪费,并降低不能完全分辨靶标的可能性。

Twist 寡核苷酸池满足上述所有标准(规模、长度、精度和均一性),因此,各种功能基因组学应用的开发人员转向 Twist 以满足他们的 DNA 合成需求2-5。

如果您有兴趣使用 Twist 寡核苷酸池进行空间基因组学实验,请扫码查看高通量筛选的寡核苷酸池页面了解更多信息。

参考文献

1. Fasolino, Maria et al. “Genetic Variation in Type 1 Diabetes Reconfigures the 3D Chromatin Organization of T Cells and Alters Gene Expression.” Immunity vol. 52,2 (2020): 257-274.e11. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.003

2. Takei, Yodai, et al. “Integrated Spatial Genomics Reveals Global Architecture of Single Nuclei.” Nature, vol. 590, no. 7845, 1 Feb. 2021, pp. 344–350, www.nature.com/articles/s41586-020-03126-2, 10.1038/s41586-020-03126-2.

3. Su, Jun-Han, et al. “Genome-Scale Imaging of the 3D Organization and Transcriptional Activity of Chromatin.” Cell, vol. 182, no. 6, 17 Sept. 2020, pp. 1641-1659.e26, www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867420309405, 10.1016/j.cell.2020.07.032.

4. Beliveau, Brian J., et al. “Visualizing Genomes with Oligopaint FISH Probes.” Current Protocols in Molecular Biology, vol. 105, no. 1, Jan. 2014, 10.1002/0471142727.mb1423s105.

5. Nguyen, Huy Q., et al. “3D Mapping and Accelerated Super-Resolution Imaging of the Human Genome Using in Situ Sequencing.” Nature Methods, vol. 17, no. 8, 27 July 2020, pp. 822–832, 10.1038/s41592-020-0890-0.

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