【文献分享】当SMARTer RACE和In-Fusion用于制备单抗

【字体: 时间:2022年04月13日 来源:Takara

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  下面通过两篇文献,来分别了解SMARTer RACE技术和In-Fusion无缝克隆如何助力单个B细胞抗体制备过程。

单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。自1975年杂交瘤单克隆抗体技术问世以来,单克隆抗体便迅速的在生命科学研究领域以及临床检测、诊断中得到了广泛的应用,为很多领域的研究以及疾病的诊断和治疗做出巨大贡献。目前单克隆抗体制备技术有杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体展示技术、转基因小鼠技术以及单个B细胞抗体制备技术等【1】。

其中单个B细胞抗体制备技术是近年来新发展的一种独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的快速制备单克隆抗体的技术。这种技术以B细胞为起始,利用每个B细胞只含有一个功能性轻链和重链可变区 DNA序列,以及只产生一种特异性抗体的特点,可以直接从单个B 细胞中扩增抗体基因,获得单个B细胞所表达的抗原特异性抗体。这种方法保证了抗体轻重链可变区的天然配对,具有高通量、高效率、全天然源性、基因多样性更丰富等优点,是目前快速开发针对抗病毒感染性疾病抗体的要策略,具有更广泛的应用前景。

单个B细胞抗体制备技术过程包括:鉴定和分离单个B细胞;扩增和克隆抗体基因;表达、筛选和鉴定抗原特异性抗体等步骤。其中扩增未知抗体基因时,需要设计通用性强、灵敏度高、特异性好的引物进行巢式或半巢式RT-PCR,才能扩增出完整的抗体基因序列,避免非特异性扩增,这对引物设计要求非常高。而在实际应用时,受可变区序列多样性的限制,很难设计出通用的引物涵盖所有分选到的B细胞功能性抗体基因。此外,如果进行高通量抗体筛选,还需要将扩增到的大量抗体基因克隆到表达载体上,但使用传统的酶切连接方法需要耗费大量的时间、成本和精力。

下面通过两篇文献,来分别了解SMARTer RACE技术和In-Fusion无缝克隆如何助力单个B细胞抗体制备过程。

文献一:《Sequence analysis of feline immunoglobulin mRNAs and the develop- ment of a felinized monoclonal antibody specific to feline panleukopenia virus》

摘要

由于在B细胞中编码重排重链和轻链免疫球蛋白的mRNA缺乏物种特异性完整序列,基于抗体的免疫治疗在猫中的应用受到限制。为了克服这个问题,研究者从猫外周血单个核细胞(PBMC)中分离出mRNAs,并使用现有的免疫球蛋白序列和5′与3′RACE去克隆和测序重链和轻链免疫球蛋白的mRNAs。利用这些序列,制备了两个双顺反子载体,用于表达哺乳动物具有代表性的猫重链(IGHG1a)和轻链(lambda或kappa)。文章报告了新的猫免疫球蛋白序列,表达抗原特异性猫化单克隆抗体的技术,以及抗猫泛白细胞减少症病毒的功能性猫化单克隆抗体的初步特性。

RACE文库构建

SMARTer® RACE的原理是当SMARTScribe反转录酶(RT)到达mRNA模板的末端时,会自动添加几个非模板碱基,这时试剂盒中预置的SMARTer II A Oligonucleotide因有一段修饰的碱基序列即可与cDNA的尾部退火,并作为SMARTScribe反转录酶的延伸模板,反转录酶会自动转换模板继续延伸cDNA,直到SMART Oligo的末端,无需额外的加接头或加尾操作,最终生成末端带有SMARTer序列且对应原始RNA的完整的cDNA拷贝,特别适用于抗体可变区调取的高通量研究,不需要针对可变区费尽心思设计引物。


图1. SMARTer cDNA合成的机制。

本文作者就是使用试剂盒中预置的引物(UPM)搭配自己设计的基因特异性引物对不同 Ig 片段(IGHV、IGHC、IGLV、IGLC 和全长 IGK)进行了PCR 扩增,基因特异性引物设计思路和序列如下:


图2. 猫 Ig 重链和轻链结构示意图。显示了用于生成 5' 或 3' RACE 文库的引物的位置。FR,框架区;CDR,互补决定区。

表1. RACE文库中使用的引物

结果

测序后共得到71个独特的IGH可变区(IGHV)和96个IGH恒定区(IGHC)RACE序列,50个独特的IGLV序列,5个IGLC基因,37个全长IGK转录本的独特序列,经过与现有数据库信息比对和确定,成功地鉴定了新的全长IGHA、IGLV、IGLC和IGK序列。 将鉴定到的猫IgG重链和轻链(lambda、IgL和kappa、IgK)的代表性全长序列克隆到载体中,并将含有猫IgG IgL或IgG IgK的双顺反子载体转染到HEK细胞中进行表达,经检测,分泌的抗体链已成功组装成完整的抗体分子。作为原理证明,后续又通过将大鼠抗CPV单克隆抗体的CDR交换到表达载体主干中,生成了一种针对CPV和FPV的Felizized单克隆抗体,检测后证明经修饰的单克隆抗体功能齐全,并保持其抗原识别能力。构建的猫科动物表达载体将有助于在猫身上开发创新的抗体疗法。

文献二:《Rapid high-throughput cloning and stable expression of antibodies in HEK293 cells》

摘要

基于单个细胞的抗体可变区扩增是克隆抗原特异性单克隆抗体的快速而有效的技术,从最初的筛选过程(包括少量的数百或数千个单克隆抗体)到体外鉴定,再到随后的体内实验(只需要少量的单克隆抗体),拥有一个从克隆到稳定细胞系制备的强大的单克隆抗体生成系统是至关重要的。本文开发了一个强大的高通量单克隆抗体发现和生产系统,集成了高效克隆和稳定池选择方法的优点,减少了克隆和表达大量可变区基因所需的时间和精力,从4到6个月减少到4到6周。

高效克隆

在单个HCs和LCs的克隆过程中,最大的瓶颈是在抗生素琼脂平板上选择重组转化子和随后的菌落筛选,这需要耗费大量时间。利用高效的不依赖连接酶的In-Fusion无缝克隆试剂盒可省略这些步骤,且不存在载体自连产生的背景。 In-Fusion Cloning是一种无需连接酶、高效率的无缝克隆技术,基于载体和插入片段序列之间的同源重组原理,有助于快速、准确地将任意PCR片段克隆到任意目的载体中,背景低,克隆保证方向性,单片段克隆的成功率超过95%。In-Fusion克隆的快速和易用性以及结果的准确性,使系统可轻松应对高通量的工作流程。

实验方法

使用In-Fusion HD克隆将V区cDNA插入片段克隆到其C区线性化载体中。转化后,每个转化产物取50 μl加入到含1 ml TB的96-well深孔板中摇动培养过夜。对培养物进行小规模质粒提取,将HC和LC质粒共转染至HEK293细胞当中进行8-10天的培养,传代后在条件培养基以及药物中进行选择以及扩展培养,并对表达的mAb进行


图3.高通量克隆、转染和稳定细胞系选择的流程图。

为了验证和量化该克隆方法,除了对半克隆的DNA进行测序以确认所需插入片段的存在之外,还从克隆B细胞群中RT-PCR扩增了44个VH基因和51个VL基因,并克隆到C区载体中。用限制性内切酶对半克隆DNA池进行小量制备,结果显示绝大多数LC质粒(98%)和HC质粒(95.4%)含有预期插入片段 取出小部分转化液进行平板划线,通过菌落PCR筛选以确定是否存在插入物,进一步定量每次转化中带有插入物的质粒的百分比,HC质粒的平均百分比为71.6%,LC质粒的平均百分比为81.1%(下表),这一数据在后续不使用酶切法制备质粒后又得到了大幅提升(推测是限制酶不完全酶切造成)。

结果

从单个B细胞中扩增VH和VL区,并分别插入双顺反子的恒定区载体中,转化产物省略涂平板分离单菌落的步骤,可将克隆过程从1到2周缩短到2到4天。由于整个体系是将HC和LC的表达与抗生素抗性基因的表达连接起来,理论上所有抗生素耐药细胞都表达mAb,无需对细胞分选富集或对高产细胞进行亚克隆,从而将先导mAb快速转移到大规模生产中,加之后续对共转染细胞培养和筛选过程的优化,可额外节省7至8周。总的来说,本文开发的半克隆方法将从克隆到稳定细胞系开发的时间缩短了3到5个月。

本文作者和他的同事也评估过其他的克隆方法,之所以选择In-Fusion主要是看重了它的易用性、无自连背景和高阳性克隆率,这些都是省略涂平板筛选单克隆步骤进行高通量实验的必要前提。

通过以上两篇文献分享,我们不难看出SMARTer RACE和In-Fusion无缝克隆技术在单个B细胞抗体制备过程中的推动性作用,SMARTer RACE技术是克隆新基因的有效方法,尤其重要的是,它在扩增抗体可变区这样变异度很高的基因时,操作简单成功率高,克隆得到的基因信息全面,保证了抗体的活性和功能。而利用In-Fusion的高正确率和无载体自连背景干扰的特点,可进一步简化操作流程,省略涂平板筛选步骤,转化后的产物直接培养提取质粒用于后续的共转染,可将克隆过程大幅缩短,特别适用于mAb研发过程中的大规模高通量筛选。期待研究人员的进一步摸索和尝试,更希望看到以上两种方法的双剑合璧以及进一步拓展优化,为单个B细胞抗体制备技术在药物研发过程中带来更多的可能性。

如果您看了文献之后跃跃欲试,不妨买它回去试试!


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参考文献

[1] Wang SX. Advances in the production of human monoclonal antibodies. Antibody Technol J, 2011,1:1-4.

[2] 吕信萍, 吴静, 陈京涛. 单个B细胞抗体制备技术及其在肝脏疾病中的应用[J]. 临床肝胆病杂志, 2015, 31(12):2104-2109.

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