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METIS算法使用的增强顶点设计表明，设计的不同类别的2D对象将保持平面，尽管需要进一步的实验来支持这一假设。
摘要
二维（2D）DNA折纸被广泛应用于从激励剂到单分子生物物理学的应用。传统的单层2D DNA折纸在溶液中表现出柔韧性和弯曲性；然而，这可能会限制其作为二维结构模板的适用性。相比之下，二维线框DNA折纸用六个螺旋束边缘渲染，提供了对双重取向的局部控制，增强了平面内的刚性。在这里，我们使用低温电子显微镜（cryo EM）研究这些组件的三维结构。三维重建显示，对于有或没有内部网格的多边形对象，解决方案具有高度的平面性和均匀性，使三角形的分辨率达到10°。粗粒度模拟与冷冻电镜数据一致，为这类二维DNA折纸提供了分子结构方面的见解。我们的研究结果表明，这些组件对于需要高结构保真度以及对双重取向进行局部控制的二维材料应用和几何结构可能是有价值的，而不是并行的双重组装。
简介
DNA折纸术是由P.Rothemund在2006年发明的(1)通过在DNA中绘制立体二维（2D）几何图形，包括正方形、三角形、星星和笑脸。在第一个实现中，直线平行的DNA双工体与交叉的反平行DNA链相互连接，这些链由来自M13噬菌体基因组的长支架链杂交成数百条较短的合成短链。这种直线或类似砖块的制造策略是强大的，因为它提供了直接的支架串布线和装订顺序设计手动或使用简单的计算机辅助设计工具(2)，使得非专家可以广泛使用该技术。然而，由于这些二维折纸对象几乎完全是用原子力显微镜（AFM）或透射电子显微镜（TEM）在2D表面上显示出来的，所以尽管物体在3D溶液中有弯曲、弯曲或扭曲，但它们通常看起来是平坦的(三–5)。虽然三维结构预测工具如CanDo(6)用于减少平面外变形(7–9)，平面度的实验验证仍然是难以捉摸的，以及获得和保持任意二维几何图形平面度的一般设计规则。近年来，人们对单层平行双工二维DNA折纸的平面性进行了研究和控制(10,11)，解决方案中这些组件的三维结构仍然是难以捉摸的，可能是因为它们在溶液中的灵活性和非均质性，溶液散射数据证实了这一点(10)和原子力显微镜(11)一个例外是最近的3D冷冻电子显微镜（Cryo EM）研究，该研究揭示了平行组织的单层双工的矩形折纸具有显著的灵活性和弯曲度，最初由Rothemund实施(1)而在同一份报告中，刚性和基本均匀的多层砖状折纸的三维结构被重建成核苷酸分辨率(12).
尽管在实验上难以实现和验证，二维折纸的平面性对于寻求以纳米级精度组织二次材料的众多应用来说至关重要(13,14)包括光收集和激进剂的基础研究(15–18)，单分子(19–21)以及超分辨率成像(19,22)，分子生物物理学(23)，光子学(24)细胞生物物理学(25–28)以及基于表面的图案和光刻技术(29,30).多层蜂窝(31)和方格(32)砖块状的折纸设计提供了制作单层二维折纸的替代品，但由于所需支架的长度增加，它们在实现平面性的同时，还降低了可以渲染的对象的整体横向尺寸；它们可能需要仔细的序列设计，通过结构模拟和实验的迭代反馈来减少或消除固有的扭曲(6,8,9,32)，它们在很大程度上仅限于绘制由整个对象中的平行双工组成的直线几何体，并且(33)或者没有弯曲(1,34).使用高亲和力配体-受体对将2D单层折纸贴附于表面可用于部分平坦物体，尽管由于AFM的扰动性质和TEM的低对比度，实验验证再次具有挑战性，并且许多应用不适用于这种生化固定策略。
二维线框DNA折纸作为一种直线、砖块状折纸的替代品，最近出现了一种在2D中定位次级材料的替代品，具有纳米级的精度和对双轴的局部定向控制(35,36).与传统的直线砖状折纸相比，线框几何可以呈现直线双工组件无法访问的多面体几何体(35,36);它们减少了呈现给定横向尺寸的二维物体所需的总支架长度，因为它们具有开放的网状结构，最大限度地减少了DNA的使用，而且它们还提供了一些应用中可能需要的双方向的局部定向控制，例如组织发色团来控制分子激子(37–39)和光子学(30).
全自动序列设计工具METIS（机械增强和三层折纸结构）原则上提供了使用多层、六螺旋束（6HB）边缘渲染平面二维线框对象的能力，尽管到目前为止，实验表征被限制在二维成像中，这种成像同样会受到来自二维固体支撑的潜在伪影的影响(35)在这里，我们报告三维冷冻电镜的结果，以解决平面二维DNA折纸结构的第一个例子，使用6HB线框设计，横向尺寸高达80nm。为了测试可制造的二维物体的宽度和多样性，我们研究了两类不同的线框物体，它们是有内部结构的多边形物体和没有内部结构的多边形物体。此外，为了确定可以以这种方式渲染的对象的大小，我们将侧边长度从42到210个碱基对（bp）变化。三维重建表明，我们的方法可以得到均匀的、平面的物体，分辨率为10到18，这表明平面度的结构偏差最小，横向尺寸可达80nm。这类平面DNA折纸是从上到下使用全自动序列算法METIS(35)在图形用户界面（GUI）ATHENA中实现(40)为二维纳米材料的设计和图案制作提供了广泛的应用。
结果
二维折纸的计算机辅助设计
利用METIS绘制了基于6HB边缘的二维线框DNA折纸结构。为了研究折纸对象的平面性，我们选择了不同的目标平面几何结构，包括六边形、五边形和对称与不对称的三角形。为了评估内部网格对平面度的影响，我们绘制了有无内部线框支持的六边形和五边形（表S1）。最后，如前所述，生成具有不同边长的五边形(40)探讨横向尺寸对获得的平面度的影响。
二维线框折纸的平面度
METIS算法利用6HB edge motif来获得边缘的结构刚性和相邻边缘中每个双工之间的最大顶点交叉数，从而赋予整个对象整体刚度和理想的平面度(图1).虽然这种带有多向顶点连接的多层设计先前被证明与每个边仅由两个双工组成的基于DX（双交叉）的对象相比，增强了平面内的结构完整性，在这项工作中，AFM和TEM表征无法确定溶液中装配结构的平面外变形与平面度(35).
利用不同的目标边界几何形状，包括六边形和五边形，我们首先使用Cryo-EM来评估这些有无内部网格的物体的平面度(图2)为了提高目标二维线框结构的面内结构保真度，采用AFM和TEM对其进行了验证(35)低温电磁成像和三维重建证实，无论内部网格是否存在，物体不仅具有精确的内角，而且在其横向80nm尺寸范围内保持在~6nm范围内的平面(图2)六边形和五边形具有内部网状结构，其最小边长为84bp，而相应的中空结构则为六边形指定了106bp的最小边长，而五边形的最小边长为122bp，以获得相同的80nm直径。如所示图2A在成像过程中，正对着我们设计的六边形内部网状结构与我们的设计一致，这与它的AFM和TEM图像是一致的(35)不过，现在，这些结构在没有任何表面限制的情况下被冻结在溶液中。
不同方向的单个DNA结构也可在玻璃质冰中识别，其平面性在二维物体的不同方向上很明显，最明显的情况是在垂直方向的二维物体上（图S2）。对于具有内部网格的五边形结构（图S3），以及没有内部网格的六边形和五边形结构也进行了类似的观察。如图所示。S4和S5，空心六边形和五边形在溶液中都是平面的，在低温电磁成像中垂直定向时显示为一条直线。虽然大多数物体在单粒子水平上是平面的，但偶尔，结构也显示出一些曲率（图S2至S6）。然而，单粒子不均匀性足够低，因此很容易生成二维类平均值。
除了实现复杂线框折纸对象的平面性外，这些三维重建还提供了我们所知的尺寸为80nm的2D cryo-EM-DNA折纸结构的首次报告实例。在另一项研究中观察到，物体沿一个轴旋转不仅显示出平面性，而且缺乏整体扭曲(12).虽然我们的结构中的大多数6HB边没有显示扭曲，但五边形物体的内部网格确实显示出左旋扭曲，这在内辐条边缘上很明显。这与赝原子模型与密度图的相关系数一致：内网格的五边形结构的相关系数为0.75，低于内网格六边形结构（0.82）。对于空心六边形和五边形，相关系数分别为0.84和0.83（表S2）。这四个物体的分辨率也具有可比性，六边形和五边形的内部网格分别重建为18和17？的分辨率，两个空心结构重建为16？分辨率。
边缘长度对平面度的影响
针对线框折纸在没有内部网格的情况下所获得的平面度，我们选择五边形作为模型几何，研究改变边缘长度是否会影响平面度。比较84和122bp的最小边长五边形结构表明，尽管边缘长度发生变化，平面度仍保持不变，基于傅立叶-壳相关（FSC）曲线，分辨率为16(图3A无花果。S5和S6）。对于这两种结构，生成的伪原子模型预测（蛋白质数据库或PDB文件）与密度图吻合良好，相关系数均为0.83，且无论边缘长度不同，边缘均无明显扭曲。因为两个结构之间的边缘长度的差异不是DNA螺旋圈数的整数倍，所以两个五边形顶点上的钉交叉模式是不同的，尽管两个物体的顶点角度是相同的（图S7）。两种低温电磁结构的分辨率、模型拟合和质量是相同的，这一事实表明我们的顶点设计参数通常是有效的。与单一DNA双链或基于DX的边缘相比，使用6HB边缘的一个离散优势是其相对较大的1到2μm的持久长度与其刚性相关(41,42)，这对于线框DNA折纸的结构完整性，特别是在这里制作的空心结构至关重要。为了进一步研究边缘长度的变化，用冷冻电镜对5个边长为42～210bp（14～71nm）的五角形结构进行了表征(图3B)边长为42-126bp的较小尺寸的五边形可以很容易地适应玻璃质冰中的不同方向，在低温电磁成像中可以观察到它们的平面性。相比之下，边缘长度为168bp的五边形基本上是规则的，尽管由于其尺寸较大（直径约100nm），它们在成像过程中采用的明显方向较少。当边缘长度达到210bp时，在五边形结构的边缘和顶点处可观察到扭结和弯曲，根据低温电磁成像结果，为实现具有精确内靶角的平面目标，METIS的外形尺寸上限为~100nm，边缘长度为~60nm(图3B).
渲染对称对象与非对称对象
为了测试非对称物体是否能保持平面性，我们对最大边长为84bp的不对称三角形和对称三角形进行了检查，重建的整体分辨率分别为11和13°，平面度与目标内角再次保持在一起。为了研究三角形结构的结构保真度，建立的伪原子模型来拟合三维冷冻电磁重建的密度图。原子模型与密度图的总相关系数对称三角形为0.85，非对称三角形为0.87。对于对称三角形，顶点处缺少密度，从重建的密度图可以看出。这与先前工作中的分子动力学模拟是一致的(35)，在顶点处观察到更高的局部构象柔度。局部分辨率图还显示了所有顶点中对称三角形和非对称三角形的较低分辨率，而在边缘观察到最高分辨率，对称三角形的分辨率高达10°（图S10）。对于非对称三角形，虽然顶点显示出更好的分辨电子密度，但最短的边显示出向外弯曲，这种弯曲在这个对称三角形物体的其他边上只略微可见。比较对称三角形和非对称三角形的冷冻电磁重建，还可以测试对称结构的分辨率是否受到类平均和三维重建过程中施加对称性的限制。图S11显示了粒子数与地图分辨率之间的线性关系(43)，B因子估计为1954.5和2276.82分别是对称三角形和非对称三角形。因为从这些图中可以推断出，使用相同数量的粒子（甚至是数量的三倍）进行重建将导致对称三角形和非对称三角形的分辨率相似，这表明，不仅分辨率的限制是由对称性引起的，而且顶点设计、6HB整体刚度和结构保真度也可能是限制最高分辨率的因素。对称三角形的整体分辨率为11°，非对称三角形的分辨率为13°，这是迄今为止6HB结构实现的最高分辨率。
二维折纸物体的分子模拟
为了深入了解所设计折纸对象的分子水平结构和灵活性，我们使用oxDNA2进行了粗粒度分子动力学模拟，以补充实验低温电磁数据(图5)使用oxDNA2粗粒度模型是因为它准确地表示了DNA的热力学和力学性质，同时与经典的全原子模型相比，它能够以较低的计算成本进行长时间的模拟(44,45).作为本研究中最大、最复杂的线框折纸，首先选择具有内部网格的六边形和五边形DNA折纸对象进行oxDNA2模拟（图S12和S13）。模拟显示了二维DNA对象的一般平面性和不同对象的不同灵活性，用相对于平均结构的RMSF（均方根涨落）值来表示(图5)与六边形结构相比，五边形结构在顶点上表现出更高的柔度，这与我们的实验数据一致，即重建的五边形物体存在密度缺失和边缘弯曲。另外，对结构分辨率最高的两个三角形进行了模拟，对称三角形与我们之前的全原子分子动力学模拟结果吻合良好(35)此外，与六边形和五边形等较大结构相比，这两种三角形物体的RMSF值都较低。然而，RMSF分析显示顶点处具有更高的灵活性，而边缘显示出与平面度的微小临时偏差，从而导致平均非常平坦的结构（详细的RMSF值和结构文件在补充资料中提供）。在单个螺旋的级别上，与边相比，交叉和循环之间的更大间距导致顶点处的灵活性更大，并且在急弯的内部显示更为明显。总之，这些模拟证实了这些METIS设计的二维DNA折纸物体的高结构保真度和平面性。
讨论
2D DNA折纸是一种应用非常广泛的功能材料制作模板，应用于分子生物物理学(23)，激进剂(15–18)，光子学(24)，和等离子体光子学(14)在其他方面。在目前的工作中，我们研究了使用METIS算法设计的二维线框DNA折纸的平面性，其特征是独立的cryo-EM。平面性表现为规则的形状，如六边形和五边形物体，无论内部是否用内网格加强，总的横向尺寸为~80nm。此外，用cryo-EM将一个不规则、不对称的三角形重建为13°分辨率，再加上对称三角形高达10？分辨率，代表了迄今为止基于6HB基序的DNA折纸冷冻电镜结构的最高分辨率。METIS算法使用的增强顶点设计表明，设计的不同类别的2D对象将保持平面，尽管需要进一步的实验来支持这一假设。这些二维平面DNA折纸可能在未来被用作一个平台，如蛋白质(28,46,47)，发色团(48,49)，和纳米粒子(50,51)具有高结构保真度的解决方案，这为不同的二维功能材料和生物分子应用打开了令人兴奋的可能性，通过开放源代码软件METIS及其GUI-ATHENA，广大研究人员可以访问这些应用。
