简介
昼夜节律钟是一种内在的基因计时机制，存在于大脑和几乎所有的外周组织细胞中，大约在24小时内运行。生物钟通过不同的周期（如光和暗、体温、休息和活动）协调特定组织的生理活动(1).核心时钟机制，由转录激活剂组成，Bmal1和Clock以及转录抑制因子，Per1/2和Cry1/2形成一个自动调节负反馈回路，驱动有节奏的基因表达。这个转录-翻译反馈回路调节输出基因，例如Rev-erbs、Dbp和Nfil3。
昼夜节律时钟驱动许多其他基因的表达，这些基因被称为时钟控制基因，这些基因是组织特异性的，通过它们的时间特性在维持组织内稳态中起着重要作用。昼夜节律紊乱和随后这些生物钟控制基因表达的中断与肥胖、糖尿病、心血管疾病和骨关节炎（OA）等疾病有关(2,4,7,8).
时钟基因在许多不同的肌肉骨骼组织（包括肌肉、肌腱、骨骼和关节软骨）中起着维持组织内稳态的关键作用(4,9).关节软骨由丰富的细胞外基质（ECM）组成，细胞外基质由唯一的驻留细胞类型软骨细胞合成(10–12).关节软骨是无血管和无耳的，通过合成代谢和分解代谢之间的平衡来维持。这种平衡的破坏，例如，通过增加炎症，驱动关节软骨的退化，这是OA的一个关键特征，OA是全世界疼痛和残疾的主要原因(13–15).已有研究表明，关节软骨中的许多合成代谢和分解代谢途径具有不同的日常动态，由软骨细胞中的功能性昼夜节律时钟驱动，有助于维持软骨的稳态(4,9,16–23).一些细胞功能表现出一天中的时间依赖性活动，包括代谢、ECM重塑和分解代谢途径(4,20)时钟的中断会导致节律性表达的丧失和这些途径的表达改变(20).例如，一个核心时钟基因的软骨特异性敲除（KO），Bmal1公司，导致小鼠的分解代谢反应和软骨降解(18).这些发现提示软骨昼夜节律紊乱可能是OA发病的重要因素(24).
炎症是OA发病机制中的一个关键驱动因素，其特征是促炎细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）水平的增加，而这些细胞因子又反过来，通过促进降解酶和其他促炎症介质的产生，诱导细胞外基质降解，从而将软骨细胞活性转变为促代谢状态(25–29).炎症已被证明扰乱软骨的昼夜节律(30).在软骨外植体中加入IL-1会导致昼夜节律的丧失，而这种节律只有通过使用消炎剂地塞米松（dex）才能挽救(30).抗细胞因子治疗如IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra；anakinra）在减轻创伤后OA的症状方面显示出了希望(31–33);然而，系统性的抗细胞因子治疗是在高剂量下进行的，这可能会产生非靶向效应，包括增加对感染和某些自身免疫疾病的易感性(34)以及有限的组织再生和修复(35–37).
由于抗细胞因子治疗的缺点和缺乏有效的疾病治疗来解决OA的症状和结构变化(38–40)，我们利用基因工程来发展各种自我调节的细胞系统来解决这些局限性(41).利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，我们建立了小鼠诱导的多能干细胞（miPSCs），该细胞缺乏功能性IL-1受体1（IL1R1），可以成功地分化为组织工程软骨，而组织工程软骨可防止IL-1诱导的基质降解（IL1R1-KO）(42).我们还利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在miPSCs中整合IL-1Ra（一种IL-1的竞争性拮抗剂）。IL-1Ra是一种竞争性的IL-1拮抗剂，以控制IL-1Ra的产生，以应对炎症和随后的Ccl2激活（43）。这些细胞还能够保护软骨免受炎症介导的降解（43）。此外，我们还开发了一种由活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NF-κB）激活的合成启动子，以驱动我们所需的转基因IL-1Ra（NFκBr-IL1Ra）的产生（44）。NF-κB信号通路是关节软骨中的一个关键炎症通路，由多种细胞因子（如IL-1）激活，导致其他促炎介质的上调。这种慢病毒基因疗法已被证明在miPSC衍生的组织工程软骨和原代猪软骨细胞中抑制IL-1对炎症或机械负荷的反应（44，45）。
因为昼夜节律钟在维持软骨组织内环境稳定中起着关键作用，基因表达的改变就证明了这一点(20)软骨退化(18)由于昼夜节律的紊乱，以及最近发现炎症可以驱动软骨细胞昼夜节律的中断，本研究的目标是利用基因工程干细胞开发组织工程化软骨，以维持炎症反应的昼夜节律。因此，我们试图建立一个测试昼夜节律在软骨维持中的作用的平台，并通过在将miPSCs分化为软骨细胞的过程中首先测试昼夜节律出现的时间，然后测试炎症信号对软骨细胞昼夜节律和软骨完整性的影响，在测试我们的基因工程电路保持昼夜节律的能力之前。然而，请注意，未分化的干细胞或祖细胞通常不显示昼夜节律(46).因此，我们首先验证了昼夜节律和软骨基质共同发展作为软骨分化的一部分的假说。接下来，我们确定了炎症细胞因子对我们的组织工程微丸的昼夜节律的影响，并确定IL-1α和IL-1β（而不是TNFα）导致昼夜节律的破坏。然后，我们测试了以IL-1为靶点的基因工程细胞疗法保护生物钟不受IL-1诱导的干扰的能力。我们展示了我们的自我调节合成基因电路的能力，以保持日常的节律性，并防止炎症介导的破坏和软骨退化。这些发现进一步加深了我们对软骨中昼夜节律协调及其对炎症细胞因子反应的破坏的理解，并通过合成生物学和干细胞基因电路的组织工程相结合引入了“时钟保持”机制的概念。
结果
miPSCs的昼夜节律随着软骨形成的各个阶段而发展
为了评估软骨形成过程中昼夜节律的发展，我们用Per2-Luc（P2L）或Bmal1-Luc（B1L）慢病毒转导miPSCs和预分化iPSCs（PDiPSCs），并跟踪miPSCs、单层PDiPSCs、琼脂糖中新铸PDiPSCs和软骨形成软骨颗粒的生物发光输出（图2A）。我们发现，miPSCs表达P2L和B1L，但没有昼夜节律振荡的证据（例如周期>32小时；图2B）。此外，在PDiPSC分化阶段，P2L转导的PDiPSC开始振荡（平均周期=28.1±3.1小时，平均值±SEM），发育中Per2表达后出现的B1L振荡（46）尚未发生（周期长度>32小时；图2B）。然而，在三维（3D）琼脂糖系统中铸造的PDiPSCs在Per2中显示出增强的节律性（平均周期=26.3±2.2小时），而Bmal1保持心律失常（周期长度>32小时；图2B）。组织工程化软骨颗粒显示Per2和Bmal1在反相时的高振幅振荡，表明我们的组织工程化软骨中的生物钟已经充分发育（P2L周期=23.2±3.1小时，B1L周期=21.5±4.9小时；图2B）。
炎症会破坏天然软骨和组织工程软骨的生物钟
接下来，我们研究了炎症细胞因子IL-1α、IL-1β和TNFα对组织工程软骨颗粒昼夜节律的影响。先前已有研究表明，IL-1β通过生物发光振荡的丧失和时钟基因表达的改变，导致小鼠软骨外植体昼夜节律的中断；然而，TNFα没有影响（30）。在这些研究中，我们以病理生理水平的细胞因子、IL-1α（1 ng/ml）、IL-1β（1 ng/ml）、TNFα（20 ng/ml）或磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照，治疗用P2L慢病毒报告基因转导的成熟组织工程软骨。在添加细胞因子前3天记录P2L的生物发光跟踪。添加2μl体积的细胞因子，并在添加细胞因子后的3天内跟踪颗粒生物发光。为了确定这些细胞因子对昼夜节律的影响，我们分析了周期和振幅的降低，因为它们被认为是昼夜节律中断的主要标志。振幅降低表示时钟基因表达的振荡减少，昼夜节律减弱。还收集了受到炎症激发的颗粒，用于关节软骨主要成分硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）的组织学和生化分析，并分析了炎症基因Il6和Ccl2的上调。对sGAG进行组织学和生化分析，以确定添加细胞因子后细胞因子对软骨基质的影响，sGAG染色和浓度为细胞因子诱导的软骨基质降解提供了敏感的测量方法。在添加细胞因子之前，所有颗粒均显示P2L的昼夜节律振荡（n=46；图3A）。用PBS处理的小球在记录结束时保持昼夜节律（n=20，PBS前周期=25.4±3.1小时，PBS后周期=25.6±7.2小时；图3A），并在体外培养中显示出振幅的每日下降，类似于未受干扰的对照小球（图S1）。用TNFα处理的粒剂也继续保持昼夜节律振荡（n=7，七个粒剂中有五个在处理后有节律，TNFα后周期=27.6±3.8小时；图3A）。用IL-1β处理的粒剂在所有粒剂中显示出周期延长（n=8，8个粒剂中的6个在处理后有节律，IL-1β后周期=29.5±4.6小时；图3A）。相反，经IL-1α处理的粒剂显示出快速的昼夜节律丧失（n=11，11个中的6个在处理后呈节律性，IL-1α后周期=31.7±6.6小时；图3A），生物发光幅度降低（P=0.037；图3B）。每个治疗组的非标准化、代表性痕迹在平均生物发光中表现出个体差异，这证明了标准化组水平数据的显示是合理的（图S2）。然而，所有振幅和周期测量都是从非标准化记录道进行的。来自PER2：：LUC小鼠的软骨外植体也受到炎症激发，并记录生物发光输出（图4）。与我们的组织工程软骨颗粒类似，TNFα对软骨外植体的昼夜节律没有影响；然而，与对照组相比，给予1 ng/ml的IL-1α和IL-1β的昼夜节律迅速消失，与PBS对照组相比，振幅显著降低（分别为P=0.0021和0.0005；图4）。PER2生物发光的诱导可在所有组中观察到，包括PBS治疗组，这是一种常见的观察到的现象，是由于PER2在细胞应激反应和调节哺乳动物雷帕霉素靶（mTOR）中的作用，这是一种细胞生长途径（47，48）。我们的组织工程软骨和离体软骨外植体的昼夜节律表达和对炎性细胞因子的反应相似，支持它们作为体外模型系统的应用。
抗IL-1基因工程组织能够抵抗昼夜节律紊乱
用IL-1α和IL-1β处理的软骨外植体通过添加消炎剂dex恢复了昼夜节律的丢失（图4）。此前，研究表明，forskolin作为一种昼夜节律同步器，无法在用细胞因子处理的软骨外植体中恢复昼夜节律，只有服用抗炎剂才能恢复炎症引起的昼夜节律紊乱（30）。因此，我们试图测试我们的抗炎细胞疗法是否能够在IL-1α存在的情况下保持昼夜循环。在这些研究中，我们使用了三种细胞系，旨在通过不同的机制抑制炎症反应（图5A）。为了测试IL-1是否通过IL1R1干扰昼夜节律，我们使用了未经IL1R1编辑的miPSC CRISPR-Cas9（IL1R1 KO）（42）。用CRISPR-Cas9编辑的miPSCs结合Ccl2位点下游的IL-1Ra（Ccl2-IL1Ra）（43），使我们能够通过能够抑制IL-1介导炎症的快速激活动力学研究内源性回路激活的影响。与Ccl2-IL1Ra系统相比，慢病毒电路结合了由驱动IL-1Ra（NFκBr-IL1Ra）生成的NF-κB信号通路激活的合成启动子，使我们能够研究合成激活系统对IL-1Ra生成增加的影响。所有的miPSC细胞系或miPSC均被含有P2L报告基因的慢病毒载体转导，并分化为组织工程软骨颗粒。然后我们用IL-1α治疗，并评估这些颗粒维持软骨完整性和昼夜节律表达的能力。
讨论
通过将组织工程、合成生物学和生物钟生物学相结合，我们开发出了能够保存软骨生物钟的细胞基组织结构，以应对诸如IL-1诱导的炎症等破坏性刺激。虽然近年来在了解生物钟的生理学方面取得了重大进展，但以前还没有使用遗传方法来创建基于细胞的生物钟保护治疗系统。在这里，我们使用软骨细胞和组织工程软骨作为我们的模型系统，它提供了一个均匀的细胞群体，避免了从多种细胞类型解释数据的复杂性。利用这个系统，我们已经能够揭示软骨昼夜节律的特点，并建立了一个稳健的系统来研究外周生物钟。这些类型的工具可用于缓解昼夜节律紊乱起作用的疾病(4)，可以通过时钟控制的基因确保组织的稳态，从而创造出更好的工程组织(4,9)，并可能被用来揭示生物钟的重要特征还不为人所知。与组织工程相结合，使用转基因细胞可以形成具有固有时钟保持特性的功能性生物人工组织。
在定量miPSCs中时钟基因表达的过程中，我们观察到未分化细胞没有节律性，并且在软骨分化过程中形成了昼夜节律。这与先前的报道一致，即小鼠胚胎干细胞和其他干/祖细胞在分化之前不能产生昼夜节律(46)提示成熟的昼夜节律钟的形成是细胞分化的一个整体特征。我们在PDiPSCs中检测到Per2的每日节律，而不是Bmal1。与先前关于小鼠胚胎细胞时钟发育的报告（46）一致，这一发现可能表明节律发生的起始阶段，并可能反映出该系统检测Bmal1弱节律的能力存在一些限制。此外，我们观察到，组织工程软骨颗粒中的iPSC衍生软骨细胞或原代猪软骨细胞与原代小鼠软骨表现出类似的昼夜节律反应，并对炎症细胞因子产生类似的反应，表明这种iPSC软骨生成模型复制了天然软骨的许多特征。在这方面，此类体外模型系统可用于揭示整个软骨形成过程中昼夜节律发展的关键特征，以及对驱动疾病进展的炎性细胞因子的反应。这种方法可以扩展到其他iPSC分化谱系和其他刺激，以进一步了解发育中的生物钟。
尽管生物钟在关节软骨生理学和OA病理学中起着关键作用，但生物钟基因维持软骨细胞内稳态的机制仍有待确定。在这里，我们展示了软骨细胞因子对昼夜节律的不同反应。通过检查病理生理浓度的影响(49)在生物钟上的细胞因子IL-1和TNFα以及软骨细胞外基质和炎症相关基因中，我们确定导致基质降解和其他促炎细胞因子如Il6 促使昼夜节律紊乱，而不是TNFα等细胞因子对生物钟、基质降解或上调没有影响第六章。TNFα和IL-1β对昼夜节律影响的差异，以前被认为是由于IL-1β激活NF-κB信号通路，而TNF-α缺乏激活(30).此外，用IL-1（而不是TNFα）处理的微丸中ECM成分的丢失表明，IL-1激活的导致基质降解的途径也可能导致每日节律的丧失，这反过来又加剧了基质的丢失。在用细胞因子处理的软骨中观察到(30)Per2节律性的快速衰减可能是由于昼夜节律细胞比例的减少或节律细胞间的同步性。单细胞成像可以验证这样一个假设，即治疗降低了昼夜节律细胞的比例和细胞间的同步性。这些信息和细胞因子测试模型系统将有助于阐明每种细胞因子直接作用于什么，并帮助我们揭示炎症细胞因子和生物钟之间的直接联系。
在这项研究中，一个有趣的观察结果是软骨外植体、猪软骨细胞和组织工程化软骨颗粒中的昼夜节律在细胞或组织缺乏外源性夹带线索的情况下得以维持(50).成年小鼠软骨外植体的多日记录显示，振荡维持了10天以上，没有任何干扰，如介质变化或板块移动。这种维持昼夜节律的生物钟在组织外植体中并不常见，它突出了一个潜在的有趣的研究领域(51,52).虽然先前的一些研究已经描述了软骨细胞的昼夜节律及其对关节内稳态的影响，但尚不清楚软骨细胞如何在关节软骨内维持其昼夜节律。据推测，体温的变化和滑液中的因素有助于生物钟的同步(1,9)但在没有任何同步信号的情况下，生物钟在体外的长时间维持表明，可能是软骨细胞自身分泌的一种因子维持了这种同步性，或者丰富的细胞外基质维持了同步性的生化和生物力学生态位(53).未来对潜在同步因素的研究将是揭示这一机制的关键。
我们的基因工程方法维持生物钟的能力也为治疗的发展开辟了一个不同的领域。许多疾病都与生物钟的紊乱有关(2,4,7,8).使用基因治疗方法来创造细胞疗法，专注于保存或同步生物钟，可以成为帮助改善OA以外疾病的有用武器。例如，在存在炎症的情况下，这些回路可用于通过IL-1诱导的炎症来保护其他肌肉骨骼组织，例如椎间盘，后者显示出与关节软骨相似的昼夜节律和细胞因子敏感性(2,54).利用组织工程和创造能够维持昼夜节律的细胞，超越炎症驱动的回路，为开发针对其他疾病（如与年龄相关的生物钟减弱或癌症）的额外工程细胞疗法开辟了可能性(55,56)通过维持生物钟和参与组织内稳态的相关基因(4,9).
使用一种能够保护自身免受炎症的工程组织，并在炎症反应中保持生物钟，可以克服目前OA治疗和关节软骨修复的局限性。这项工作可以扩展到创建时钟保存细胞治疗跨许多组织通过分化已发展的iPSC株到其他组织或使用慢病毒方法。例如，NFκBr-IL1Ra慢病毒系统已用于miPSCs和原代猪软骨细胞，用于炎症激活和机械反应性药物输送(44,45).未来在比较节律转录体和理解节律保存的有益效果方面的工作将进一步有助于深入了解软骨钟的生理学。这种方法为创造基于细胞的治疗方法以维持生物钟开辟了一条创新的前沿。总之，这一发展时钟保存细胞系统的框架提供了一种新的自我调节方法来建立治疗和加强组织修复。
