珍贵的眼泪：泪液蛋白质组学分析质谱流程比较 寻找健康和疾病的生物标志物

我们熟悉血检、尿检、口腔拭子鼻腔拭子，眼泪里包含数千种蛋白质，能用来检测吗？Sharma等用一种无创无痛方法采集泪液，配合Orbitrap高分辨质谱分析，从人类泪液样本中鉴别出数以千计的蛋白质，将来泪液检查将有望跟血液检查一样常规。

　　

美国乔治亚州的研究人员在《国际分子科学杂志》(International Journal of Molecular Sciences)上发表报告称，用Schirmer试纸条无创无痛地放在眼睛上可以捕获足够的泪液用于详细的蛋白质分析。他们建立一种试纸条内蛋白质消化方法，结合高能碰撞解离和 Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪，从 11 名健康受试者的人类泪液样本中使用鉴定出 3370 种蛋白！

文章摘要

泪膜是一种多层液体，覆盖眼睛的角膜和结膜上皮，提供润滑、营养和保护免受外界环境的影响。泪液含有高浓度的蛋白质，被认为是眼部疾病生物标志物的潜在来源，因为它靠近眼表的疾病部位并且可以用非侵入性方法收集。在干眼症的情况下尤其如此，干眼症直接影响泪膜及其成分。泪液的蛋白质组学分析具有挑战性，主要是由于蛋白质的动态范围宽和样本量小。然而，质谱技术的最新进展彻底改变了蛋白质组学领域，即使样本量很小，也能实现前所未有的深度、速度和准确性。在这项使用 Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪的研究中，作者比较了四种不同的质谱工作流程，用于对通过 Schirmer 试纸条收集的泪液进行蛋白质组学分析。他们建立一种条内蛋白质消化方法，该方法可在 11 名健康受试者的人类泪液样本中鉴定出合计超过 3000 种蛋白质。这种方法在识别的蛋白质数量上有了显著的改进。

背景
泪膜是一种 2-6 µm 的分层液体，由粘液层和脂质层组成，覆盖眼表的角膜和结膜上皮。粘液层含有粘蛋白和水性成分，最内层的粘蛋白层保持水层平滑，覆盖在眼睛表面，帮助保持湿润，帮助滋养角膜。粘蛋白浓度向水层梯度递减。泪膜的最外层是一层薄的脂质层，可防止粘膜水层的蒸发 。泪膜的蛋白质和脂质通过抗炎、抗氧化和抗菌活性保护眼睛 。在健康条件下，眼泪还可以为顶端上皮细胞提供营养，并为眼表提供润滑，以去除碎屑并防止磨损。眼泪的水性或脂质成分分泌不足、激光眼科手术和炎症性疾病（如干燥综合征）可导致泪膜破裂，使眼睛更容易受到感染和炎症。因此，该薄膜的完整性对于维持正常视力和防止眼部损伤是必要的。泪液蛋白是鉴定用于诊断和监测干眼症及其潜在病理生理学的生物标志物的潜在来源。

过去，泪液的蛋白质组学分析由于体积小而具有挑战性。质谱技术的进步，如 Orbitrap 离子阱质量分析仪，提高了从非常小的样品体积（例如泪液）中鉴定蛋白质的深度、速度和灵敏度。束型碰撞解离碎裂技术，例如碰撞诱导解离 (CID) 和高能碰撞解离 (HCD)，可以高可信度地鉴定肽及其潜在的翻译后修饰 。这些改进允许对小样本量进行精确和高通量的蛋白质组学分析，使其成为鉴定泪膜中蛋白质和肽的理想方法。为了提供来自泪液的高价值蛋白质组学数据，需要对泪液蛋白处理方法和质谱分析进行严格测试。在本研究中，作者比较了使用质谱法分析泪液蛋白质组的四种不同工作流程，包括两种不同的蛋白质消化方法（提取后蛋白质消化和试纸条内蛋白质消化）和两种片段化技术（碰撞诱导解离 (CID) 和高能碰撞解离 (HCD)），片段化是利用动能促使分子碰撞，从而将蛋白质分解成更小的多肽以便分析。

讨论
在本研究中，作者比较了四种不同的工作流程，包括两种消化方法和两种碎裂方法，以建立用于人类泪液样本蛋白质组学分析的优化工作流程。试纸条内蛋白质消化方法在识别的蛋白质和肽的数量方面产生了明显的改善（相比先从试纸条上洗脱方法），HCD 片段化则为识别和评估翻译后修饰（如糖基化）提供了额外的信息。鉴于泪液中的糖蛋白含量丰富 ，以及它们在维持眼表稳态方面发挥的重要作用，HCD 片段化结合试纸条内消化被选为泪液蛋白质组学分析的最佳工作流程；这将有助于未来的糖蛋白组学研究。

使用选定的工作流程，共鉴定出 3370 种独特蛋白质，每个样品平均鉴定出 678 种独特蛋白质。值得注意的是，作者的工作流程不涉及将多个条带合并在一起以增加蛋白质检测。

由于眼表疾病并不总是双侧的，而且每只眼睛都有不同的特性，因此可以在疾病状态和泪液蛋白质组学特征之间建立更准确的相关性。因此，这种方法可用于未来的研究，识别眼部疾病中的泪液蛋白质组生物标志物。这是开发临床使用的诊断和预后分析的第一步。

眼泪中最丰富的蛋白质确定为免疫球蛋白、角蛋白和补体家族的成员。由于这些蛋白质在介导免疫功能和屏障保护中的作用，检测泪液中的这些蛋白质家族提供了识别干眼症 和其他眼表疾病的生物标志物的潜力。特别是，在保护眼睛免受病原体侵害方面发挥作用的免疫球蛋白是该分析中发现的最丰富的蛋白质家族——在泪液中总共检测到了 61 种免疫球蛋白。已知免疫球蛋白 A (IgA) 存在于粘膜中，在泪液中的高表达。IgA 由泪腺的腺泡细胞产生，然后被分泌到泪膜的水层中，抗体的作用是中和病原体并阻止它们粘附和侵入眼表细胞。最近一项研究发现泪液中免疫球蛋白链分布的差异与圆锥角膜有关，这是另一种眼表疾病。因此，在这个小队列中的大多数样本中鉴定出的 Ig 链的多样性为深入了解不同的免疫介导的眼睛病理提供了机会。

大多数泪液样本中也存在 17 种补体家族蛋白。这一发现支持了“在健康个体的角膜和泪液中发现了补体系统的低水平组成型激活”的观点。虽然补体系统在眼表上的确切作用尚不清楚，但有人提出免疫或炎症反应可能引发侵袭性补体级联防御。鉴于炎症介导损伤的可能性，需要进一步研究眼表补体系统的相互作用。

除了免疫调节家族外，载脂蛋白家族在泪液中也有很高的代表性，在分析中发现了 11 种载脂蛋白。载脂蛋白 A1 ( APOA1 ) 和 A2 ( APOA2 ) 主要在肝脏中产生，并且以携带胆固醇作为高密度脂蛋白 (HDL) 的组成蛋白而闻名。在睑板腺中，APOA1起到逆转胆固醇转运的作用，防止游离胆固醇的积聚，否则会导致睑板腺功能障碍 (MGD)。此外，之前的一项研究表明，APOA2在糖尿病患者的眼泪中上调 。

眼表的结构蛋白，如角蛋白和肌球蛋白，通常存在于健康和患病条件下的泪液中。角蛋白由睑板腺产生，形成眼睛的保护层 。肌球蛋白在细胞类型中普遍表达，它们的细胞功能多种多样，包括在极化、运动和胞吐中的作用。实验中检测到 26 种角蛋白家族蛋白和 15 种肌球蛋白家族蛋白。

更多细节请参考原文

结论
研究表明，泪液蛋白质组学可用于发现多种眼部和全身性疾病的诊断和预后生物标志物，包括干眼症、翼状胬肉、圆锥角膜、青光眼、糖尿病视网膜病变、癌症、系统性硬化症和囊性纤维化。由于其广泛的可能应用，处理眼泪的优化工作流程可能具有巨大的转化潜力。在这项研究中比较了不同的质谱工作流程，并建立了一种更灵敏、更可靠的泪液蛋白检测和分析方法，可用于未来的泪液蛋白质组学生物标志物研究。

作者说——预计有一天，泪液检查可以像体检时的血液检查一样常规，也可以用于诊断从干眼病到阿尔茨海默氏症等各种疾病。

Ashok Sharma表示:“通过确定与健康泪膜及其屏障完整性相关的途径和蛋白家族，我们的发现进一步加深了我们对泪膜的理解。”Sharmas说，泪液和血液中的生物标志物可能有些重叠。他认为这项技术最快的应用可能是开发与阿尔茨海默病等特定疾病相关的特定蛋白质的测试。科学家也正在建立在泪液中发现的东西与阿尔茨海默氏症和帕金森氏症等疾病的联系。例如，在痴呆症患者的泪液中发现了tau蛋白水平显著升高的证据，tau蛋白是大脑中神经原纤维缠结的主要成分，被认为是阿尔茨海默病的生物标志物。这项研究一在网上发表，这项技术就开始被其他研究疾病生物标志物的科学家所接受。

他们的目标包括开发一个健康个体的蛋白质数据库，免费提供给其他致力于识别异常的蛋白质生物标记物疾病和追求自己感兴趣的生物标志物开发的科学家。Ashok Sharma说，

“我们正试图创建这些蛋白质的健康档案的范围是什么，”他说，他们还将他们的技术用于客观诊断常见的干眼症，包括对这种疾病进行亚分类，以便能够识别，哪些疼痛、干涩的眼睛是由自身免疫性疾病引起的。自从他们完成了发表的研究以来，他们已经检查了82个人的泪液，其中一半患有干眼症，他们开始寻找可能最终成为该疾病的生物标志物的差异。

他们还在比较眼球内帮助塑造形状的房水和泪膜的蛋白质分布。在与MCG眼科医生和验光师的合作中，Ashok Sharma一直尝试在房水这个更大但更难以收集的液体中寻找青光眼的生物标志物，尽管大多数人可能认为，青光眼并不总是由眼球内的更高压力确定的。他想知道泪液和房水是否能提供类似的线索，尽管很明显两种液体的来源不同。

尽管泪液中有很多蛋白质，但获得足够量的泪液来分析它们在技术上一直很困难。研究中介绍了一种采集泪液的方法，从而有望扫清通往未来泪液检测的一个主要障碍——他们说的不是收集我们难过时流下脸颊的眼泪，因为这些眼泪被稀释了，不是生物标志物的良好来源。而是将Schirmer 试纸条放在远离泪腺的远眼角，大约5分钟，直到泪液湿润，覆盖并保护我们的眼睛。这样已经收集了大约10到15微升的泪液，远远少于一滴。“这个方法是无创的，”Shruti Sharma说。

现在，Sharma正在向国家眼科研究所申请资助，以便建立一个健康、多样化群体的数据库，并提议以1600人的代表性人口来建立数据库。Ashok Sharma说，运行一个样本大约需要一个小时，建立数据库可能需要一年左右。