专家谈如何应对NGS靶向富集中的挑战

与其他生物学方法一样，靶向富集也有其自身的挑战。在此，Integrated DNA Technologies公司的研发副总裁 Steven Henck 博士提供了一些实验技巧，希望能帮到你。

近年来，新一代测序（NGS）技术在不断进步，意味着测序的速度和通量向前迈出了一大步，而且全基因组的测序变得更加经济实惠。虽然NGS显著降低了测序成本，但对整个基因组进行测序的成本仍然是比较高的，如果您只是对其中的一小部分感兴趣，那似乎没有必要。

在这种情况下，您可以采用靶向富集（target enrichment）方法，对感兴趣的区域进行选择性测序。这能够实现更高的测序深度，或测序更多的样本，同时最大限度降低成本。

尽管有多种方法可富集感兴趣的序列，但目前常用的方法有两种：扩增子方法和杂交捕获方法。基于扩增子的富集是使用一组PCR引物来扩增感兴趣的区域，然后对其进行纯化和测序。杂交捕获方法则采用一组杂交探针来拉下感兴趣的区域，同时洗掉未结合的DNA片段。

与其他生物学方法一样，靶向富集也有其自身的挑战。在此，Integrated DNA Technologies（IDT）公司的研发副总裁Steven Henck博士提供了一些实验技巧，希望能帮到你。

设计扩增引物

在实验开始之前，您确实需要花点时间来准备一下，以确保您的引物或杂交探针能够选择性地富集您感兴趣的区域。在使用基于扩增子的富集方法时，引物设计至关重要，因为如果引物中存在过多变异或引物形成二聚体，则扩增反应无法有效启动。您可以考虑现有的设计工具甚至设计服务来简化这一过程。

杂交捕获的优势

如果感兴趣的区域比较大，那自然需要更多的引物，这就增加了引物相互结合并产生二聚体的可能性，让基于扩增子的富集过程充满挑战。然而，杂交捕获探针在相互作用时不会产生无关的序列，因此这种方法特别适合较大的感兴趣区域。

杂交捕获方法的另一个优点是它不需要太多背景知识。除了杂交序列之外，您并不需要对目标序列有太多的了解。因此，对于序列背景并不完全清楚的样本，或可能含有大量或复杂变异的样本，在富集时最好采用杂交捕获。

此外，杂交捕获还可以应用于癌症标志物的发现。除了点突变之外，当不同基因在DNA断裂点融合时，也会形成癌基因。这些难以测序的融合基因有可能改变基因表达、活性或功能，使其具备致癌性。不过有了杂交捕获，只要您捕获了第一个片段，您就能够对那个融合点进行测序并检测到这种基因融合突变。

设计重叠引物

对于包含变异的感兴趣区域，尽管杂交捕获富集方法很有用，但基于扩增子的富集也是可行的。研究人员最近就修改了基于扩增子的富集方法，成功地对新冠病毒（SARS-CoV-2）变体进行测序。

对SARS-CoV-2变体测序而言，一些传统方法是颇具挑战性的，因为为原始病毒株设计的引物难以扩增和检测Delta和Omicron突变株。不过，使用重叠覆盖的引物能够维持检测的有效性并对新的突变株进行测序，而不会出现缺口或丢失。

别忘了标准化

测序运行的费用尽管一直在下降，但仍然是比较高的。若必须达到最低深度的序列覆盖，那么成本又会攀升，因为代表性高的区域将被过度测序，以确保代表性低的区域达到最低深度。为防止这种情况，需要进行标准化（normalization）。

一些人开始尝试在成本较低的小型台式测序仪上进行测试运行，根据质量对每个文库进行定量。与过度测序相比，利用这些方法来标准化靶向富集文库能够节约数千美元。

Henck博士认为，靶向富集是一种有用的工具，让人们能够关注感兴趣的区域并舍弃不感兴趣的区域，从而简化NGS。有了它，人们能够以更高的深度对更多的样本进行测序，并且对高度可变或未知的区域进行测序。这给实验规划带来了很大的灵活性。近年来，靶向富集已应用在多个重要的研究领域，从抗击新冠疫情到检测致癌突变，未来其应用范围还将继续扩大。