实用技术FAQ:病毒包装问答小百科(上)

【字体: 时间:2022年05月23日 来源:赛业生物

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  科研人员在做病毒包装实验中常遇到一些问题,比如为何病毒包装出毒量很低?包装出来的病毒感染细胞效率低?感染细胞后生长状态差怎么办等,为了让大家在病毒包装这块少走弯路,赛业生物针对 病毒包装常见的问题为大家进行经验总结与心得分享。

    慢病毒(Lentivirus, LV)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)改造而来的一种病毒载体,属于逆转录病毒。慢病 毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中,实现目的基因的持续稳定的表达目的产物, 因此,目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达,干扰和基因敲除。

    腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)由直径约 26nm 的二十面体蛋白质衣壳和约 4.7 kb 的单链 DNA 基因组组成。主要以游离于染色体的附加体形式存在,并可长期存在于非分裂期的细胞中。由于具有高组 织特异性、低免疫原性、良好的扩散性、高安全性以及宿主范围广等特点,AAV 特别适用于体内的研究, 且已成为基因治疗领域中最具前景的病毒载体之一。

    然而,在做病毒包装实验中,科研工作者常遇到一些问题,比如为何我的病毒包装出毒量很低?包装出来 的病毒感染细胞效率低?感染细胞后生长状态差等,为了让大家在病毒包装这块少走弯路,赛业生物针对 病毒包装常见的问题为大家进行经验总结与心得分享。

 一、慢病毒(Lentivirus, LV)

1、慢病毒(LV)几个基本概念

(1) 滴度(Titer):单位体积液体中有感染能力的病毒数目;单位:TU/mL(活性滴度单位),指每毫升 中含有的具有生物活性的病毒颗粒数;TU 为“transducing units”的缩写,中文为“转导单位”,表示 可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

(2) MOI(multiplicity of infection):感染复数,感染时活的病毒颗粒数和细胞数量比值;MOI 值=病毒滴 度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数。

2、你们是用什么方法来检测 LV 滴度的?

    慢病毒滴度的测定方法主要有 4 种,即 Elisa 法检测病毒颗粒中 p24 蛋白,PCR 法检测病毒颗粒 RNA 和检 测整合到基因组的病毒 DNA,以及通过 FACS 对荧光蛋白的表达水平。

    我们采用的是定量 PCR 检测整合到细胞(293T)基因组中病毒 DNA 的方法,慢病毒介导外源基因以逆转 录方式整合进目的细胞基因组,此方法只检测有活性的且经过逆转录的病毒 DNA,检测结果相对最准确。 因为 ELISA 和检测病毒 RNA 的方法检测的只是病毒颗粒的量,包括无活性的病毒颗粒,这会使得滴度检 测结果偏高,而我们实验是需要有活性的慢病毒才能发挥转染作用,FACS 法所检测的荧光蛋白则受到启动 子及荧光蛋白在目的细胞表达水平的影响,会使得检测结果偏低。

3、LV 多久能拿到病毒?拿到后 LV 怎么保存?

    一般情况,慢病毒包装整个过程包括载体构建(2~3 周),病毒包装+扩增(1~2 周),检测(约 1~2 周), 顺利的话 4 周左右可以拿到病毒,慢的话不会超过 6 周。

    收到病毒后若要长期保存则需放入–80℃冰箱,可保存一年左右;若一周内可以用完,则放入 4℃冰箱即可, 建议不超过 3 天。慢病毒应尽量避免反复冻融,理论上每次冻融会让病毒活性降低约 10%,因此对于冻融 的病毒,使用前建议重新进行滴度检测,或考虑分装使用。

4、怎么确认我的实验需要多少 LV 病毒量才够?那么多规格该怎么选?

(1) 由于 LV 的感染谱很广,可以感染分裂期和非分裂期的细胞,对于大部分的细胞类型,采用 1×108 TU/mL 的规格即可满足要求,另外由于目前慢病毒多用于体外细胞的感染而少用于体内注射,因此非纯化亦 可。

(2) 对于难感染的细胞,如原代细胞,需要较高的 MOI,需要的病毒量也较多,建议选高规格,如 1×109 TU/mL。

(3) 对于较为少见的细胞类型所需要的病毒量,可通过参考文献或预实验确定。

5、慢病毒载体最大可插入多大的基因片段?

    慢病毒载体的载量为 6-6.5 kb 左右,但一般建议插入的片段大小不超过 5 kb,这样包装出来的病毒滴度较高, 若超过 6 kb 则会显著降低病毒滴度。实际病毒包装中,我们常需要插入报告基因(如 GFP)和抗性基因(如 Puro),这使得目的片段的容量进一步缩小至 3 kb 左右。我们目前通过载体优化,例如删去不必要的基因, 减小启动子长度,可使目的基因的片段容量扩大到 4 kb 左右。

6、LV 载体构建的关键组成元件包括哪些?

(1) 启动子:广谱性:CMV、CAG、EF1a、PGK、SV40、U6;特异性:CaMKIIa、hSyn 等。

(2) 蛋白标签:3×FLAG、HA、6×HIS;采用融合表达的方式,表示外源蛋白的表达水平。

(3) 抗性:真核抗性:Puro、Neo、Hygro、BSD 等;原核抗性:Amp、Kan,用于细菌培养质粒扩增。

(4) 荧光:GFP、EGFP、mcherry、mNeonGreen 等,既可通过融合也可非融合的方式表达,用于检测感染效果。

7、为什么 LV 包装出毒量很低?

(1) 细胞状态:LV 的包装一般使用 293T 细胞,293T 细胞的活力、生长状态,是否处于对数生长期、铺板 是否均匀等对病毒的产量影响很大。

(2) 目的基因:目的基因的大小、序列及翻译的蛋白是否含有毒性均会影响包装效果;若目的片段较大(> 2.5 kb),则可能会导致包装滴度下降,甚至无法包装。某些过表达会产生细胞毒性的蛋白,可能会导 致细胞异常从而出毒量低(可考虑更换为腺病毒)。

(3) 质粒质量:做好空载质粒的阴性对照(GFP 组),确保包装目的基因的质粒载体构建完整。

(4) 收毒时机:转染后 24、48 h 观察细胞生长状态及荧光状态,生长状态良好一般于 48 h 第一次收集病毒 上清,换液后于 72 h 再次收集病毒上清。

(后继待续,下载完整电子版请填写联系信息)

8、包装出来的 LV 感染细胞效率低?
9、感染细胞后生长状态差?
10、不同的细胞种类使用的 MOI 值不同,如何确定慢病毒 MOI 值?
11、用 LV 做基因的干扰表达效果差?
12、LV 过表达效果差?
13、LV 如何介导多个基因同时表达?
14、都能转染细胞,LV 和 Adv 选哪个?


二、腺相关病毒(AAV)
1、AAV 病毒、慢病毒和腺病毒基本特性有什么区别
2、实现 AAV 在动物体内表达需要注意哪些关键点?
3、为什么很少用 AAV 做细胞感染?
4、如何通过 AAV 实现体内的特异性表达?
5、AAV 作为一种体内常用的工具病毒,可实现什么功能?6、AAV 感染后荧光弱?
7、AAV 感染后过表达效果弱?
8、AAV 的表达效果能维持多久?
9、AAV 病毒的操作、使用安全性怎么样?
10、AAV 的注射方式,有尾静脉注射也有局部原位注射,该怎么选?
11、AAV 注射小鼠,多少病毒量才够呢?
12、AAV 注射后多久起效?有办法缩短其表达时间吗?
13、AAV 体内注射纯化的目的是什么?
14、为什么 AAV 是目前基因治疗领域最热门的载体?

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