【字体: 时间:2022年05月30日 来源:赛业生物

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  本手册提供了三种常见神经退行性疾病:阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症(渐冻症)的经典研究流程,包括症状、病理机制、模型构建和选择。应用和实验、案例分析,极具参考价值,资深实验服务供应商赛业生物诚意奉献,可别错过!

目录
神经退行性疾病简介
1.神经退行性疾病是人类当前的巨大挑战
2.神经退行性疾病造成的损伤
3.主要神经退行性疾病的发病率

神经退行性疾病的一般研究方法
1.常见的神经退行性疾病及模型
2.基因编辑与疾病动物模型
3.小鼠·人类在神经退行性疾病中的年龄关系
4.神经科学研究中最常用的表型分析手段

神经领域客户引用文献精选

阿尔茨海默病的研究流程
1.阿尔茨海默病临床研究现状
2.阿尔茨海默病基因编辑小鼠模型
2.1传统阿尔茨海默病模型
  2.2 经典阿尔茨海默病模型的表型
  2.3 其它阿尔兹海默病相关基因
3.手术/药物在阿尔茨海默病研究中的应用
4.阿尔茨海默病研究中的认知行为学实验
5.AD病理标志物
  5.1 Aβ及老年斑是AD的核心病理特征 
  5.2 APP剪切过程中的中间产物
6.信号通路研究
7.阿尔兹海默症研究案例解析

帕金森病的研究流程
1.帕金森病简介
  1.1帕金森病的症状
  1.2帕金森病的病理特征
  1.3帕金森病的药物/疗法开发
2.模型的构建/选择
  2.1 PD基因相关模型
  2.2手术/药物处理模型
3.行为学实验
4.帕金森病的病理检测
5.帕金森病的信号通路研究
6.帕金森病研究案例解析

肌萎缩侧索硬化症的研究流程
1.肌萎缩侧索硬化症简介
  1.1肌萎缩侧索硬化症的症状
  1.2 肌萎缩侧索硬化症的流行病学特征
  1.3肌萎缩侧索硬化症的病理机制
2.肌萎缩侧索硬化症模型的构建/选择
  2.1最早发现的肌萎缩侧索硬化症相关基因SOD1
  2.2 肌萎缩侧索硬化症中TDP-43的异常聚集
  2.3 其它和肌萎缩侧索硬化症相关基因
  2.4 C9ORF72基因在肌萎缩侧索硬化症中的作用
  2.5不同动物模型的应用场景…
3.肌萎缩侧索硬化症相关行为学实验
4.肌萎缩侧索硬化症相关病理标志物
5.机理及信号通路
6.肌萎缩侧索硬化症研究案例解析
赛业生物神经退行性疾病一站式解决方案

神经退行性疾病简介

1.神经退行性疾病是人类当前的巨大挑战

    老龄化星全球当下最重要的社会问题之一,随着人类寿命的增长和发达经济体生育率的持续低下,预计到2050年全球将有21亿人年龄超过65岁,而到2100年时,这一数字将达到31亿。

    老龄化一方面造成劳动力的损失,另一方面则会导致社会的医疗成本急剧攀升。造成这种现象的原因很大程度上与老年高发疾病相关。神经退行性疾病就是一种随年龄増长发病率呈几何级数増长的疾病。目前所有的神经退行性疾病都没有特效药或者治疗方案,即便能减缓病程的药物也十分稀少,目前仅有的办法就是通过良好的生活习惯降低发病率和延缓发病时间。

    神经退行性疾病患者在过世后的尸检中基本都可以发现大脑的萎缩现象,这与神经元的死亡和树突轴突的减少密不可分,现在有无数的科研工作者和大量的经费投入到对这些疾病的研究以及药物的开发之中。赛业生物深耕生物領域多年,在神经疾病特别是神经退行性疾病方面的研究中积累了丰富的经验,本手册旨在从科研的角度介绍常见神经退行性疾病的经典研究方法,我们将基于这些经典的研究方法为客户提供便利的一站式科研服务。

(图略,详情请下载电子版原文)

2.神经退行性疾病造成的损伤

    虽然神经退行性疾病发展到后期会对整个中枢神经系统都造成损伤,并导致患者的死亡。但是在发病过程中,它们起始攻击的目标还是有所不同的:

(1)阿尔茨海默病(Alzheimer Disease, Ad)早期主要的病灶一般在海马和额颞叶部位中的锥体神经元,表现为记忆减退,对近期发生的事情非常健忘,同时精力难以集中,甚至忘记几分钟前的对话内容;

(2)帕金森病(Parkinson Disease, Pd)则是中脑黑质区域中发放多巴胺的神经元受到损伤,进而使其投射区域(主要是纹状体)的运动抑制功能失效,使想者发生非自主震颉以及运动控制能力减弱;

(3)肌萎性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)损伤的是运动皮层或者外周的运动神经,大部分患者被诊断后很快造成运动能力就会丧失殆尽,直至影响呼吸,最后死亡;

(4)亨廷顿病(Huntington Disease, Hd)患者纹状体发生神经元死亡,对自己行为和情绪的控制力变弱,认知和运动功能都会受到严重的损伤;

⑸额颞叶痴呆(Frontotemporal Dementia, FTD)和路易小体痴呆(Dementia with Lewy bodies, LBD)是以认知 记忆的损伤为主;朊病毒病(Prion Diseases)是以蛋白质改变为内因的神经病变。

    多发性硬化(multiple sclerosis, MS)针対的是轴突外的髓鞘组织,髓鞘会受到自身免疫系统的攻击,减慢和削弱神经电信号的传递,进而影响患者的运动乃至呼吸。

(大图略,详情请下载电子版原文)

3.主要神经退行性疾病的发病率

    (大图略,详情请下载电子版原文)图2展示的疾病中,AD的发病率最高,每10万人中约有1200人患病,如果将人群锁定在65岁以上的老年人中,那么患病率将超过10%。患病率排名第二的是PD,全年龄段中发病率约为0.3%。接下来是患者占比不多,但绝不能被忽视的FTD、HD和ALS。HD和FTD的发病没有明显的性别差异,其中HD属于已经明确了唯一致病基因的疾病。PD和ALS属于男性易患疾病,而且男性病患的几率几乎是女性患者的2倍,AD则相反,女性病患是男性的1.4倍左右。从遗传角度看,除了HD病是100%的显性遗传病以外,AD和PD等常见神经退行性疾病以散发病例为主。

神经退行性疾病的一般研究方法

1.常见的神经退行性疾病及模型

    研究任何疾病,动物模型都是不可或缺的,神经退行性疾病也不例外。因此,进行此类研究的第一步就是要选择或者建立适用的动物模型。目前以大鼠和小鼠为代表的啮齿类动物模型,是研究神经退行性疾病的主力,不同的疾病由于其不同的病理特征,其所针对的目标基因有所区别。以下是几种主要的神经退行性疾病模型:

AD:大部分AD模型就是针対AB前体及剪切W(PSl/2)和tau进行基因编辑而制作的。此外也有一些通过脑定位注射这两种毒性蛋白进行急性造模。此外,APOE虽然与AD有关,但本身不能作为AD模型,需要与传统AD模型逬行杂交进行研究; BACE1虽然也参与AB的形成,但目前人体并没有相关突变导致AD的报道。另一些则是以TREM2为代表的的免疫相关基因,但与APOE—样,这些基因编辑的动物目前还不能独立作为AD的动物模型存在。

PD:对于PD,a-Synuclein是构成神经元内路易小体的主要成分,自然是构建PD动物模型的主力基因。但与AD研究中APP及其剪切酶基因占据统治地位不同,家族性PD研中中PINK1、Parkin、LRRK2和DJ-1等基因占比也非常大,这些基因大多在抑制a-Synuclein的聚集和促进其降解的过程中发挥作用。不过,总体而言,PD基因编辑的模型表型没有AD疾病表型明显,因此,也经常用如MPTP, Roteona和6-0HDA等药物建立PD模型。

HD:HD是造模最简单的疾病,因为这种病是由Htt蛋白中CAGfift过多造成的,因此造模全都是针对Htt基因的,只是在基因编辑的方法和CAG重复的数量上有所区别。

ALS:渐冻症涉及的基因比较多且杂,有的位于常染色体,有的位于性染色体上;既有显性致病,也有隐性致病,因此模型也是五花八门,其中发现最早的是SODL,而近十多年釆研究得比较多的是形成蛋白聚集物的TDP-43以及散发性ALS中最常见的C90RF72。

FTD:该疾病与AD—样都有tau的聚集,又和ALS的特征蛋白TDP-43有关,但和ALS渊源最深,有很多蛋白的突变既是 ALS的诱因,同时也会诱发FTD。有意思的是,这两个疾病一个以损伤运动能力为主,而另一个主要损伤的是认知。(大图略,详情请下载电子版原文)

2.基因编辑与疾病动物模型

    由于存在伦理问题,神经退行性疾病难以通过从人身上获取组织样本开展硏充。因此包括猕猴、狨猴、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇和线虫等模式动物便被开发了出来。虽然灵长类和人更接近,理论上作为该药研究模型最为理想,但其成本过高,且实验周期长,基因编辑困难;斑马鱼和果蝇更适合高通量研究,繁殖速度快且实验成本相对低廉,但很多认知功能相关的表型研究却因其神经系统过于简单而无法进行。综合而言,啮齿类动物与人类在基因上有90%以上的相似性,且实验周期大大低于灵长类,人类的认知过程基本可以在它们身上复现,再加上已有大量研究数据的积累以及相对低保的成本,是目前最为理想的动物模型。

    随着各种核酸酶技术在2009-2013年之间井喷式的发展及以后的不断完善,尤其是CRISPR/Cas9技术的发明,使得基因编辑的效率大幅提高,难度和成本也显著降低,其在神经退行性疾病的研究中发挥着重要作用。基因编辑中转基因是先出现的,同时也是目前拥有疾病模型最多的基因操作方式,但其存在转入基因拷贝数不确定、插入位点不确定、只能过表达等缺点。因此为了基因表达更可控,同时也不至于因为随机插入而影响其他基因的表达,该方法也在慢慢被其他方法所取代。

    与増加基因表达的转基因过表达方式相反,有时候我们还需要降低或者清除基因的表达,于是基因敲除技术就诞生了,这种方法通过将整个基因或者外显子直接剔除,又或者造成移码突变使得这个基因产物彻底失去转录的激活或者完全失去功能;有报遒称小鼠有30%的基因是完全敲除致死的。因此一方面为了规避胚胎致死,一方面也为了更详细的研究,Cre-LoxP方法应运而生,这种方法可以根据连在Cre之前的启动子来决定Cre剪切酶的表达时间和表达部位,只要在被敲除的目的基因两側连好loxp位点即可。

    Cre-LoxP方法稍加改进也可以用来进行基因敲入,一方面是将两端带有LoxP的终止序列和外源基因的片段插入小 鼠基因组,种小鼠只有和Cre小鼠杂交后外源基因的终止序列被敲除后才能表达。

    由于代偿或者内含子的作用影响,单个或者几个基因的改变无法产生明显的表型,还可以针对大段的染色体进行敲除或者复制等操作,这些变化在很多遗传性疾病中也是经常发生的。

    研究动物的目的是为了应用到人身上,于是在上述基因编辑方式的基础上又产生了嵌合小鼠,这种小鼠可以同时存在不同小鼠的细胞,也可以同时存在人和小鼠的细胞,但是人的细胞加入的话存在伦理问题。

    当下最流行的模型构建方法是人源化,这种方式是将人类的基因定点导入小鼠,可以根据需要选择替代或不替代原有基因,带不带内含子,单个基因还是一大段染色体片段。(图略,详情请下载电子版原文)

    随着研究的深入,很多传统的转基因模型已经不能满足科研创新性的要求,因此,在研究新的基因与神经退行性疾病的关系以及研究精确(时间上和空间上)的治疗性药物对疾病的治疗作用时都难免涉及到药物处理或者病毒注射。为了节省广大科研工作者的精力和时间,赛业生物神经科学一站式解决方案,期待能在创新基因编辑模型和疾病模型交叉、繁育、质粒构建、病毒包装、神经干细胞基因编辑、外源病毒药物脑立体定位注射、组织病理荧光成像以及无菌鼠脑肠轴等技术工作上祝您一臂之力。让您享受一站式服务体验,将注意力聚焦于科学问题的解决,而非实验技术的学习。

3 .小鼠-人类在神经退行性疾病中的年龄关系
    神经退行性疾病相对于自闭症、精神分裂症等在青春期或者刚刚成年就有病症的精神疾病而言,发病时间较晚,绝大部分患者是在50岁以后发病(较为知名的神经退行性疾病中亨廷顿病和多发性硬化发病较早),因此相应的实验窗口也比较靠后。但目前基因编辑可以使这些小鼠疾病模型的发病时间过早,使得其与人类发病时间点的对应关系却没有那么严谨,因此在小鼠中的研究结果需要谨慎对待,不能完全照搬到人体实验。不过即便如此,动物实验作为人体实验的前哨站,其作用和贡献都是巨大的。
(图略,详情请下载电子版原文)

    由于神经退行性疾病的发病旳间问题,我们需要将小鼠饲养到适应于不同疾病的年龄才能开始进行实验,比如关于 帕金森病的小鼠大部分实验需要在10周到60周之间进行,而阿尔茨海默病的研究时间商口大多都在20周以后。转基因和 基因编辑小毆由于基因经过了改造,其繁殖力、表型都可能受到不同程度的影响,这就对小鼠的繁育和饲养提出了新的要求。

    赛业模式动物研究中心在江苏太仓(紧邻上海)、广州科学城核心区和河北固安(紧邻北京)等地拥有共计4万平方米新动物设施,拥有超25000平米的SPF级动物实验室,配备有IVC饲界设备超过1600套,可养殖SPF级别大小鼠超过15万笼,动物种群规模超过50万只。从健康检测、遗传控制到人员培训、个性化繁育等方面,全方位满足您对动物饲养繁育的要求。您可以选择获得F1代小鼠后取回自行繁育,也可以由赛业生物进行专业高效的扩繁,迅速获得足够数量的实验小鼠;扩繁之后的小鼠可以在赛业生物代为饲养到合适的年龄;您也可以再根据需求取回小鼠自行实验或者由赛业的技术服务平台继续下游实验。
(图略,详情请下载电子版原文)

4.神经科学研究中最常用的表型分析手段
    通过对三大神经生物学专业汆志(Neuron, Nature Neuroscience, Journal of Neuroscience)近五年研究性论文发表数量的统计。模型的选择方面,目前大鼠小鼠以及神经干细胞占到了50%以上,其余如细胞系、非人灵长类等占比不到一半。其中小鼠在基因编辑相关的模型领域占比最高,而大鼠因为具有更发达、更易训练等特点在神经退行性疾病的研究中有着重要的地位。此外在以大鼠和小鼠为模型的上述文献中,应用动物模型的硏究中,免疫荧光组化、行为学和病毒转染/示踪等方法尤为重要。(图略,详情请下载电子版原文)

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