烟草线粒体和叶绿体中的功能固氮酶辅因子成熟酶NifB

生物固氮是将惰性大气中的二氮气体转化为氮反应性氨，这是一种由重氮营养细菌和古细菌的固氮酶催化的反应。因为植物不能固定自己的氮。。。

　　

摘要

工程植物合成固氮酶和吸收大气氮₂将减少作物对工业氮肥的依赖。该技术可以通过表达原核固氮基因产物在植物体内组装功能固氮酶而实现。NifB是固氮酶的关键组分，因为它催化所有固氮酶活性位点辅因子生物合成的第一步。在这里，我们使用了30个不同的库nifB公司来源于不同门和生态位的序列，以恢复an的重氮营养生长藤黄固氮菌 nifB公司变种人。其中20个变种拯救了nifB公司突变表型尽管它们的系统发育距离A、 维尼兰迪.由于铁钼辅因子（FeMo-co）生物合成途径中需要多个蛋白质相互作用，异源宿主固氮酶的成熟可分为独立的模块，这些模块包含相互作用的蛋白质，这些相互作用的蛋白质共同作用产生特定的中间产物。因此，nifB公司功能模块由nifB公司变体，以及A、 维尼兰迪NifS和NifU蛋白（用于NifB[Fe]的生物合成₄S₄]簇）和FdxN铁氧还蛋白（用于NifB功能）在烟草叶绿体和线粒体。三种仿古NifB蛋白在叶绿体可溶性组分中高水平积累(乙酸甲烷八叠球菌和炼狱产甲烷球菌)或者线粒体(M、 地狱和热自养甲烷热杆菌).这些NifB蛋白可以接受[Fe]₄S₄]在FeMo共合成中具有功能的NifU和团簇体外.在植物叶绿体和线粒体中积累大量的可溶性和功能性NifB蛋白是植物生物固氮工程的关键。

重要性生物固氮是将惰性大气中的二氮气体转化为氮反应性氨，是重氮细菌和古生菌固氮酶催化的反应。因为植物不能固定自身的氮，在谷类和其他作物中引入功能性固氮酶将减少我们对氮肥的强烈依赖。NifB是所有固氮酶活性位点辅因子的生物合成所必需的，NifB可以说是全球固氮中最重要的蛋白质。因此，NifB功能是设计植物固氮酶的必要条件。表达nifB公司从广泛的原核生物基因转化为模式重氮菌藤黄固氮菌显示出惊人的基因互补水平暗示固氮酶生物合成途径的可塑性。此外，我们还从烟草线粒体和叶绿体中获得了具有功能的NifB蛋白体外通过提供[Fe]进行重组后₄S₄]来自NifU的集群，为植物固氮酶辅助因子生物合成铺平了道路。

简介

目前世界上一半以上的粮食消费是使用合成氮（N）肥料生产的，这一行业消耗了全球能源供应的约1%(1,2).不幸的是，作物只吸收了大约30%的氮肥(三)而其余的则从土壤中渗出，构成了一个主要的污染源，对环境产生了巨大的负面影响(4,5).由于植物不能固定自身的氮，将生物固氮（BNF）引入谷类作物中是必要的，以减少我们对氮肥的依赖，在保持生产力的同时保护环境(6,7).BNF是惰性大气二氮气体（N₂)进入氮反应性氨（NH_三)固氮酶催化的一种反应，仅存在于重氮营养细菌和古细菌中(8).

获得固氮禾谷类作物的一种途径是转移原核细胞镍特罗根f混合(如果)植物的基因(7).固氮酶是由两个相互作用的组分组成的酶复合物，催化组分称为二硝基酶，电子供体组分称为二硝基酶还原酶(9).固氮酶反应包括至少8个循环的电子转移和由ATP水解驱动的组分缔合/解离(10).固氮酶有三种类型：钼（Mo）、钒（V）和纯铁（Fe）固氮酶。它们在遗传上是不同的，但在功能和结构上相似，在亚基和辅因子组成上有一些差异(11).钼固氮酶是氮中分布最广、效率最高的固氮酶₂还原，和最好的特征(12).固氮酶的二硝基酶还原酶组分是固氮基因协调低电位氧化还原活性的基因产物₄S₄]并负责Mg·ATP水解。催化组分（NifDK）对应于α₂β₂-每个αβ-二聚体具有两种独特的金属团簇：铁钼辅因子（FeMo-co）和P-簇合物。[铁₈S₇]P团簇负责从[Fe]中连续的电子转移₄S₄]NifH集群₇S₉C-R-高柠檬酸盐FeMo-co酶催化辅因子(13).这三个金属团簇被O不可逆地破坏₂.

FeMo共生物合成是由NifS定向组装[Fe]₄S₄]NifU的集群单元，然后转移到NifB(14).NifB是一个S-腺苷酸-我-甲硫氨酸（SAM）自由基酶，能转化两种铁₄S₄]把单位聚集成一个₈S₉C] 名为NifB co的集群(15–18).一种由自由基产生的中心碳化物，起源于SAM(19)在NifB反应中，还引入了第九种硫化物(20).然后将NifB-co直接或通过NifX转移到NifEN支架上，再与NifH一起转化为FeMo-co(21–23).NifQ和NifV分别捐赠Mo和FeMo-co的高柠檬酸盐(24).重要的是，硝酸还原酶和纯铁固氮酶活性位点辅因子的生物合成也需要NifB(17,25)，可以说是全球固氮中最重要的蛋白质。

在数据库中，大约70%的NifB序列包含一个N端SAM基区和一个C端NifX样区(26,27).两个结构域NifB蛋白在模型重氮菌中的表达藤黄固氮菌和催产克雷伯菌在异源系统中已被证明是困难的，常常导致不溶性蛋白质的积累(15,28,29).然而，在产甲烷菌和其他原核生物中发现的由一个独立的SAM自由基结构域组成的功能性NifB蛋白(18,26,30)，可在酵母中表达。当30个不同系统发育来源的NifB变体文库被表达并以酵母线粒体为靶点时，6个变体以可溶性蛋白形式积累，2个变体被分离并显示出来体外功能(31).

在这里，我们表达了30种不同的nifB公司基因A、 维尼兰迪并观察到20个可以替代土生土长的功能nifB公司基因。这20个基因及其蛋白序列的同源性较低A、 维尼兰迪,证明了NifB产物（NifB-co）本身是簇传递的决定因素，并建议异源宿主固氮酶工程可分为独立的模块，其中一个模块的最终产物（如Fe-S簇合生物合成，在本例中为NifB-co）可转移到另一个模块（例如，对应的载脂蛋白，在本例中是NifEN），尽管每个模块中的成分来自不同的物种。然后我们将30个NifB蛋白表达并靶向于线粒体或叶绿体烟草在两个平行的筛选程序中。产甲烷菌的三种NifB蛋白在叶绿体和线粒体中均有大量的可溶性和积累。重要的是，所选的NifB蛋白支持体外用[Fe]共合成FeMo₄S₄]由生理供体NifU提供的簇状底物，证明这些已鉴定的变体是从两种植物细胞器中分离出的功能蛋白。