干货推荐！免疫细胞代谢在建立新一代细胞疗法中的核心作用

免疫细胞在微环境中的代谢重编程可以影响细胞的命运和功能。代谢物本身可以驱动细胞功能和表型，涉及增殖、分化及功能障碍。免疫细胞的代谢平衡是一个与抗肿瘤有效性内在关联的决定因素。对于理解抗肿瘤免疫反应生物学和疗法设计，免疫细胞代谢和生物能量参数分析和优化至关重要。

前言
免疫细胞就像哨兵，随时准备对外来抗原和癌细胞等多种触发因素作出迅速响应，精确可控地调节其功能。近期，我们对代谢平衡与免疫细胞功能之间复杂的动态联系有了更丰富的认识。这些理解让我们可以监测并控制代谢重编程方式，使其与微环境信号协同作用，并驱动和调节免疫细胞的功能、命运和适应性。

在本交互式电子书中，我们介绍了如何使用安捷伦 Seahorse XF 分析仪实时测量免疫细胞生物能量代谢。我们还引用了最近发表的文献示例，以说明免疫治疗领域的前沿研究者和机构如何应用这些工具来应对细胞工程、细胞构建体检测以及生产过程中治疗细胞效价监测方面的挑战。

一、代谢重编程

免疫细胞适应性、命运和活化的生物能量代谢
动态的免疫细胞功能或命运与不同的代谢重编程策略之间有着复杂的联系。在初始状态下，T 细胞主要利用线粒体呼吸 (OXPHOS) 满足 ATP 需求，其ATP 需求通常低于效应表型细胞。而效应细胞需要增加总 ATP 产生量才能满足快速增殖的要求。在这些细胞中，糖酵解贡献了总 ATP 生产中相对较大的比例，以满足加速的能量需求。

糖酵解是能量产生的快速响应机制：当能量需求急剧增加，需要快速的代谢反应时，糖酵解可以快速提供所需能量。但是糖酵解速率的提升无法持续。相比之下，线粒体负责常规的能量管理，在出现入侵后使系统恢复秩序 ― 它们关注的是恢复、平衡和持久性。如果免疫细胞无法恰当调节其代谢需求，就会导致无能或耗竭状态，而病原体擅长利用这些状态。在本章中，我们将参考可用于安捷伦Seahorse XF  分析仪的一系列检测试剂盒，了解影响免疫细胞适应性、命运和活化的生物能量代谢。这些试剂盒可用于实时测量免疫细胞代谢表型。

监测增殖免疫细胞的生物能量表型
安捷伦 Seahorse XF 实时 ATP 速率测定可在同一细胞孔中同时测量线粒体和糖酵解 ATP 的产生速率。因此，该测定提供了能量生成总量的定量标尺（总 ATP  产生速率），直接指示了不同细胞状态下的能量需求。该测定还可提供不同细胞群中这些通路之间相对平衡的定量标准（XF ATP速率指数），对细胞表型和功能提供了独特见解。

测量免疫细胞命运（谱系）和适应性（效力）的生物能量代谢标志

备用呼吸能力 (SRC) 是经过验证的线粒体功能的可靠测量指标，且已确立为免疫细胞命运和适应性的有力指标。可对免疫细胞命运和适应性的关键参数（包括记忆形成、肿瘤微环境中持久性和癌细胞持续杀伤力）进行定量测量和调节，从而优化免疫细胞的性能。

了解驱动免疫细胞生物能量代谢的底物（优化细胞生长条件）

安捷伦 Seahorse XF 底物氧化压力测试将底物通路特异性抑制剂和XF 细胞线粒体压力测试相结合。测试提供的一套检测可评估三种主要线粒体底物的氧化：长链脂肪酸 (LCFA)、葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺。

细胞可通过代谢重编程发挥功能、确定命运并影响适应性。XF 底物氧化测试试剂盒可提供以下方面的关键信息：
–哪些底物与细胞功能和表型相关
–如何调节或调控免疫细胞命运、适应性和功能，从而优化驱动谱系定向和细胞效力的特性

实时检测人T细胞活化 提供T细胞活化动力学的动态数据。

安捷伦 Seahorse XF Hu T 细胞活化测定试剂盒可深入分析不同酪氨酸激酶对 T 细胞活化的药理作用，从而比较不同调节剂和抑制剂的效力（图 A 和图 B 对比）该试剂盒为 T 细胞生物学提供了独特的视角，使研究人员能够定量分析活化动力学并研究 T 细胞行为的调节剂。

二、细胞工程

调节影响免疫细胞适应性、命运和活化的生物能量代谢
嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 疗法等工程化免疫细胞在临床上对耐药和难治性造血系统肿瘤的疗效显著。然而，工程化免疫细胞对于实体瘤的疗效有限，其原因有以下几个方面： 缺乏肿瘤特异性抗原靶标、工程化免疫细胞对肿瘤的归巢和穿透不足、肿瘤微环境的免疫抑制特性以及工程化免疫细胞缺乏持久性。

细胞疗法领域正致力于利用基因工程方法来继续增加免疫细胞疗法的活化、持久性、归巢性、有效性和安全性。越来越多的证据显示，代谢平衡可能是免疫细胞功能和在肿瘤微环境中持久性的最客观决定因素，因此不受各种免疫通路利用策略和因素的影响。因此，代谢平衡可以客观地确定哪种方法可以增强免疫细胞功能，尤其是针对难治性肿瘤，并可以推动候选疗法的动物试验以及最终的临床试验。

本章中提供了一些具体示例，其中免疫细胞的基因工程和功能都取决于免疫细胞的代谢平衡。

CAR 结构设计可通过调节代谢来增强免疫细胞的持久性
免疫细胞工程的目标在于生成具有某些特性和特征的细胞产物，从而改善免疫细胞功能并增强在肿瘤微环境中的持久性和存活能力。T 细胞生物能量代谢的功能调节与 T 细胞信号转导有着复杂联系，是决定细胞命运的重要决定因素。CAR 信号转导结构域的性质会决定细胞向效应或记忆表型分化。

Kawalekar 等人通过 XF 细胞线粒体压力测试表明，CAR 信号转导结构域的选择决定了抗原刺激后 CD8 + CAR-T 细胞的生物能量代谢表型，及其体外持久性和记忆分化。在 21 天的时间内，含有 4-1BB 信号转导结构域的 CAR-T 细胞逐渐表现出更高的备用呼吸能力， 最终使其体外持久性和中央记忆分化相比含有 CD28 信号转导结构域的 CAR-T 细胞有所增强。（查看原图请下载电子书）

通过免疫细胞基因工程进行的代谢重编程可以恢复抗肿瘤功能

通过免疫细胞基因工程进行的代谢重编程可以恢复抗肿瘤功能肿瘤微环境 (TME)  代表一种缺氧并缺乏关键营养元素的限制性环境，会导致免疫细胞耗竭。免疫细胞的线粒体功能，特别是氧化磷酸化会受到显著影响，是免疫细胞耗竭的关键决定因素。通过过表达关键基因（例如 PGC1-α）对免疫细胞进行代谢重编程，可恢复线粒体功能并增加线粒体量，从而逆转免疫细胞耗竭并恢复抗肿瘤功能。

Sharping 等人最近使用 XF 细胞线粒体压力测试表明，编码 PGC1- α 的逆转录病毒载体转导的 OT-I T 细胞线粒体功能得到改善。备用呼吸能力增加而基础糖酵解无变化（通过细胞外酸化率 (ECAR) 测量） 表明了线粒体功能的改善。T 细胞线粒体生物合成增加可改善肿瘤内T 细胞的功能，表现为肿瘤面积的减少，使肿瘤在体动物模型的存活时间延长。

组合免疫检查点疗法可通过增强代谢适应性来改善免疫细胞功能和抗肿瘤效果

活化和分化等 T 细胞的效应反应过程对能量需求较高，肿瘤微环境会施加代谢限制，导致 T 细胞执行功能所必需的关键生物能量代谢中间体生成受限。这可能大幅降低 PD-1 阻断剂等免疫检查点疗法的有效性。通过调节关键生物能量通路的治疗干预是增强抗肿瘤反应的一种富有潜力的策略。

Menk 等人使用 XF 细胞线粒体压力测试表明，与使用同型对照或单独使用抗 PD-1 治疗的小鼠相比，使用抗 PD-1 + 抗4-1BB 联合抗体治疗的小鼠的 CD8 + T 细胞具有更高的最大呼吸。此外，皮内接种 B16-F10 黑色素瘤细胞后，接受联合免疫疗法的 C57/BL6 小鼠与同型对照或单独使用抗 PD-1 治疗的小鼠相比肿瘤缩小程度也更高。这些结果表明，增强免疫细胞的线粒体能力可改善抗肿瘤反应。（查看原图请下载电子书）

肿瘤微环境通过 ER 应激反应和线粒体生物能量代谢下调对 T 细胞效应功能的影响

肿瘤微环境通过活化 IRE1α-XBP-1 未折叠蛋白反应信号转导通路激活内质网 (ER) 应激反应来抑制 T 细胞效应功能。IRE1α-XBP-1 的活化反过来限制可用的线粒体生物能量代谢关键底物 ― 谷氨酰胺，使线粒体生物能量代谢受到抑制。通过药理学抑制和基因工程下调此通路，能恢复 T 细胞功能及其抗肿瘤活性。

图 16： 通过靶向 T 细胞中的 IRE1α–XBP1 信号转导来控制内质网应激反应，从而帮助恢复代谢适应性和抗肿瘤能力

XF 细胞线粒体压力测试分析显示，CD4+ T 细胞接触卵巢癌患者不同浓度的恶性腹水后，线粒体功能随剂量增加出现下降。在相同的腹水条件下，经过 4µ8C（ER 应激蛋白 IRE1-α 的抑制剂）处理可恢复线粒体功能，表明 ER 应激反应可能会降低 T 细胞的适应性。带有卵巢癌和 XBP-1 缺陷 T 细胞的小鼠表现出更好的线粒体功能，且 IFN-γ 分泌增加，总体存活率更高，表明这些恢复的 CD4+ T 细胞具有保护性。

 

三、工艺开发和细胞生产

细胞代谢是关键的质量属性：代谢调节已成为一项关键工艺指标，用于确定细胞产品是否获得适当质量属性，是否可生产制剂并上市。

在生产中寻求离体扩增和未分化表型之间的平衡

CAR-T 分化状态是抗肿瘤活性的重要决定因素

优化细胞疗法开发的营养和生长条件：利用生物能量参数获得抗肿瘤活性提高的免疫细胞

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T 细胞生产过程中的代谢重编程可以显著影响 T 细胞分化和最终细胞产品的表型。Hermans 等人证明， IL-2 会引起高基础ECAR 和缺乏 SRC 的能量代谢，从而促进重编程，而 IL-21 可更好地维持代谢静止状态。这种代谢静止状态具有记忆 T 细胞的低基础 ECAR 和高 SRC 特征，与再刺激时的扩增潜力相关。

LDH 抑制剂的存在可重编程 T 细胞的代谢，抑制丙酮酸转化为乳酸（有氧糖酵解），并在体外扩增过程中促进了线粒体的丙酮酸氧化。LDH 抑制增强了 IL-21 诱导的表型，其特征是低基础 ECAR 和高 SRC，在小鼠肿瘤模型中进行过继细胞转移后具有更高的体内抗肿瘤活性，并延长了动物存活期。

安捷伦 Seahorse XF 分析仪提供灵敏的实时功能测量，可以客观定量地测定免疫细胞的代谢活性，从而在整个疗法设计和生产过程中提供有关免疫细胞关键质量属性的重要信息。

安捷伦 Seahorse XF 分析仪：
–可结合定制的试剂盒和检测，灵敏、动态地测量免疫细胞的命运、适应性和功能
–提供优化免疫细胞选择和工程设计的关键信息，提升细胞性能，可用于选择和设计具有优异代谢特性的工程化免疫细胞，实现出色的肿瘤杀伤功能
–可用于优化治疗细胞生产中免疫细胞组分和生长条件