【方法推荐】3D间充质干细胞hMSCs的自动分化解决方案

导读

人类间充质干细胞(hMSCs)具有多能性，能够分化为多种细胞系(包括脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞)，从多能型hMSCs到最终目标细胞系(如软骨细胞)的完全分化通常需要14 - 28天。由于需要每2到3天更换一次培养基，人工操作不仅繁琐，而且在处理非附着细胞时，会增加意外清除球体的风险。若将处理步骤自动化，并结合3D磁性生物打印方法，可以使研究人员自由地执行其他实验，并增加可重复性，几乎没有球体损失的风险。

今天向各位分享的研究，就提供了一种组合解决方案，并对该方案进行了验证。该方案可以从3D hMSCs球体中实现软骨细胞的自动分化，利用3D磁性生物打印、Agilent BioTek自动液体处理和孵育系统以及基于Cytation 5成像的分析相结合，提供了一种易于使用、稳健的方法来优化hMSCs球体创建和分化过程。

材料与方法

图1. 3D细胞培养方法

大致实验流程如下：
1.在384孔板中进行2D和3D hMSC细胞的培养，3D细胞的培养流程见图1，实验设置4组重复；
2.开始分化前，对未分化的细胞进行免疫染色，通过Cytation 5检测常见生物标志物蛋白（CD29、CD44、CD166）的表达确认hMSCs的正常功能；
3.在分化期间，将孔板置于BioSpa 8中进行长达20天的培养，期间，通过EL406每隔3天更换培养基，并在培养基更换后通过BioSpa 8机械臂自动将孔板从EL406移至Cytation 5中，基于明场成像确认培养基更换成功且不损失细胞；
4.在第5、10、20天从BioSpa 8中分别取出一个含有2D细胞和3D球体的微孔板，通过Cytation 5进行荧光免疫染色以检测胶原蛋白的表达，验证软骨细胞的分化。

结果讨论

结果一

通过对未分化细胞进行生物标志物的检测，证实了hMSCs的正常功能（图2）。

图2. 未分化hMSCs细胞生物标志物表达。A.2D细胞；B.3D细胞。（DAPI: Hoechst 33342染色细胞核，GFP: CD29表达，Texas Red: CD166表达，CY5: CD44表达）

结果二

在自动培养基更换期间，通过Cytation 5明场成像确认换液过程中细胞和3D球体的完整性（图3），3D细胞在20天的孵育过程中保持完整，而2D细胞最长可培养10天，在10天后可见明显的细胞损失，该结果也证实了之前的研究，即2D培养的细胞在孵育10天后会失去完整性和活力。

图3. 培养基更换后的成像验证。

结果三

通过比较在分化培养基中培养的细胞和在生长培养基中未分化的细胞，检测2D培养细胞的软骨细胞分化。如图4所示，软骨细胞在孵育5天内开始分化，并在10天迅速达到顶峰，而在生长培养基中培养的细胞则没有分化；10天后，2D培养的细胞全部丧失活力，在分化的细胞中，胶原II荧光探针浸出到周围的培养基中。这也证实了2D分化的hMSCs在长期研究中的局限性。

图4. 2D培养的hMSCs软骨细胞随时间分化情况。

同样的方法，通过比较在分化培养基和生长培养基中培养的的球体来检测软骨细胞在3D培养的球体中的分化情况（图5）。结果显示，未分化的球体中未见胶原蛋白表达，而分化的球体中胶原蛋白表达随着时间的推移而稳步增加，这也证实了3D培养和分化的hMSCs球体适合进行长期的研究。此外，将分化后的球形图像叠加在单个z平面上(图6)，以提高图像清晰度并能够量化分化。

图5. 3D培养的hMSCs球形软骨细胞随时间分化情况。

图6. 三维球面图像的z轴叠加与投影。(从A到C)各个z平面的图像；(D)软骨细胞分化的hMSCs球形最终z轴叠加图像。箭头表示细胞核、胶原蛋白和蛋白质表达。

结果四

通过Agilent BioTek Gen5软件的双Mask分析工具来定量软骨细胞的分化，主Mask用于识别圈选整个3D球体，次级Mask用于屏蔽球体内的区域，使得胶原蛋白II抗体标记的CY5信号高于背景阈值水平（图7）。

图7.Gen5自动双Mask分析结果。

CY5的细胞面积覆盖率即为细胞分化程度和II型胶原蛋白的表达，可通过次级Mask与主Mask的比值来计算，以百分比表示（图8）。与未分化的hMSCs球体细胞相比，软骨细胞分化后的hMSCs球体细胞中II型胶原的生成显著增加，从而验证了3D培养的hMSCs球体细胞可以成功分化为软骨细胞。

图8. CY5信号随时间的变化与背景阈值比较。

结论

▪ 由nano3D Biosciences公司生产的384孔BiO检测试剂盒和NanoShuttle-PL颗粒，结合Greiner BiO-one Cell-Repellent Surface 6孔和384孔微孔板，提供了一种简单而稳健的方法来创建仿生hMSCs球体。
▪ 通过将Agilent BioTek BioSpa 8和Agilent BioTek EL406上的磁性适配器结合在一起，可以实现分化过程的自动化，从而简化和提高所含程序的可重复性。然后通过Agilent BioTek Cytation 5的明场和荧光成像进行自动化和分化确认。
▪ 该组合为3D培养的干细胞分化提供了一种成熟的方法。

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