AFA技术助力Hi-C在表观遗传学中的应用

表观遗传图谱在表观遗传疗法的生物标志物和靶标的识别与鉴定方面具有巨大的应用前景。

除了染色质免疫沉淀(ChIP)技术外，表观遗传基因调控的研究还有其他的层面可以作为对组蛋白修饰和转录因子调控研究的补充，其中包括3D基因组、染色质可及性、DNA甲基化和ncRNA与染色质的结合分析等。

Hi-C技术源于基因组捕获技术(Chromosome conformation capture)，是分析染色质三维空间结构的一种测序方法，用于研究三维基因组，可以实现全基因组覆盖检测全部未知互作区域。

目前，对于Hi-C技术的应用也面临着诸多挑战，比如需要建立能够获得可重复性的3D构象数据、实现良好的控制性及条件优化的protocol；需要捕获所有的染色质互作，特别是在低样本起始量的情况下；需要无偏好性、可重复的剪切和紧密的DNA片段大小分布等。

以上问题如何解决？

AFA技术优势

Covaris AFA非接触式聚焦超声技术能够对几乎任何样本进行标准化的染色质制备和剪切从而得到一致的结果，为研究人员提供了一个简单、快速、可重复和可扩展的工作流程，以得到高质量的剪切片段，从而在全基因组范围内分析样本的表观遗传构成。

AFA技术在Hi-C应用的优势：
1、随机剪切保证了无偏好性的染色质片段化；
2、紧密的片段大小分布确保构建的测序文库具有综合的代表性；
3、可重复性剪切允许比较不同来源的样本，如癌症亚型或进展性疾病的不同阶段的样本。

下面来看一下近期关于Covaris AFA助力Hi-C表观遗传学研究的数据表现。

在题为《LRFN5 locus structure is associated with autism and influenced bythe sex of the individual and locus conversions》的文章中，作者Helle Lybæk等人证实了LRFN5基因座结构与孤独症（ASD）有关，并受个体性别和基因座转换的影响。

LRFN5是一个调节突触发育的基因，也是存在于一个5.4Mb哺乳动物特异性保守拓扑结合结构域(TAD)中的唯一基因，具有复杂的结构和高度的哺乳动物保护性，基因座结构改变与发育迟缓和自闭症之间存在联系。

其中作者利用Hi-C技术对LRFN5位点TAD结构进行了确定。

具体操作如下

1、使用设计工具(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)，设计了捕获 Hi-C SureSelect 文库。159,698个探针的覆盖率为70.5% ，总体大小为4668 Mb。

2、对来自家庭三人组(父母和子女)和同龄对照组女性的皮肤成纤维细胞进行了Hi-C实验。胰蛋白酶消化的成纤维细胞在PBS中洗涤，然后转移到50毫升的 falcon 管中，并辅以10% FCS/PBS，最终浓度为2% ，加入37% 甲醛，固定10min，加入甘氨酸(终浓度125mm)终止交联反应。固定细胞用冷PBS洗涤两次，用新鲜培养液(10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA 加蛋白酶抑制剂)溶解至异核细胞。在冰中孵育10分钟后，用显微镜观察细胞溶解情况。480g 离心5min，PBS洗涤一次，液氮速冻。

3、提取细胞核，对基因组进行酶切消化，接下来，将消化后的染色质分别稀释于5.1 ml H2O，700 μl 10x ligation buffer，5 μl 30 U/μl T4 DNA连接酶中，在16℃ 中培养4h。将连接后的样品在室温培养30分钟后，别加入蛋白酶 K解交联，在65℃培养过夜。

4、染色质沉淀、70% 的乙醇洗涤、干燥。最后用Covaris AFA聚焦式超声技术对构建好的3C文库进行剪切、片段化。片段化时间6分钟，片段分布在150bp左右。

5、Hi-C捕获的数据分析。

图示：来自一个三人组家庭(ASD男性患者，他的母亲和父亲)和一个对照女性的Hi-C结果。箭头表示TAD联结点(A和B)。星号标记处显示的是与TAD 联结点(A)相对应(与LRFN5启动子相对应)的172kb 的家族性缺失。

除了Hi-C以外，作者还进行了DNA甲基化、LRFN5缺失多态性的SNP分析及统计学分析等实验。

上图是对LRFN5位点H3K9me3染色质水平(相对于基因组平均值)数据的定量分析结果。柱状图显示了男性/女性的个体分布情况。

对男性ASD患者的捕获Hi-C的结果分析，显示在5.4 Mb的mega-TAD内有三个亚TAD区。用星号标记的菱形区域存在一个172kb 的缺失，除此之外还存在一个具有多态性的60kb缺失位点。

结论

本文通过应用Covaris AFA技术,进行了高质量表观遗传图谱的构建，既保证了无偏好性的片段化，又实现了对不同来源的样本的可重复性剪切。实验结果进一步说明LRFN5调节障碍可以导致男性自闭症，其结构受个体性别的影响，解释了自闭症在男性中比女性更常见的原因，为后续对于自闭症的更深入的遗传学研究提供了依据和基础。

参考文献：

H Lybæk, M Robson, N de Leeuw et al. LRFN5locus structure is associated with autism and influenced bythe sex of the individual and locus conversions. Autism Research.2022;15:421–433. DOI: 10.1002/aur.2677

Covaris自动聚焦超声技术（Adaptive Focused Acoustics,AFA)，是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声换能器将声波聚集到样本区域，对样本进行处理。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩引起的样本处理过度及热损伤。Covaris AFA通过精确的计算机控制系统和自动化的仪器操作，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

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