摘要
体细胞双链断裂（double-strand breaks）的修复主要是通过容易出错的非同源末端连接来完成的，而较少采用精确的、用同源染色单体作为模板的同源重组修复。在果蝇中，利用同源染色体的完整序列对双链断裂和单链断裂进行有效的体细胞修复，称为同源染色体模板修复（HTR）。出乎意料的是，对白眼基因位点，由Cas9衍生的切口酶10a或H840A诱导的单链断裂引起的同源染色体模板修复导致等位基因转换的效率（40-65%）要高于由完全激活的Cas9诱导的双链断裂（30%）Nickase和Cas9诱导的修复表型在发育时间（分别是晚期和早期）和不良突变事件的产生（罕见和频繁）上都有所不同。Nickase介导的同源染色体模板修复是一种高效、出乎意料的等位基因校正机制，在基因编辑领域具有深远的应用前景。
简介
CRISPR最初在细菌中被发现作为抵御噬菌体感染和外来DNA入侵的防御系统。这种天然免疫途径的组成部分经过修饰和重新利用，在真核细胞中产生特异有效的DNA切割和随后的基因编辑，在基础研究、医学、生物技术和农业等领域有着广泛的应用。当Cas9核酸内切酶与嵌合的引导RNA（单引导RNA或gRNA）配对时，它在gRNA序列定义的精确基因组位点上切割DNA。由此产生的双链断裂（DSB）可通过多种途径被细胞机械修复，这些途径可分为两大类：1. 易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径：即重新连接松散的末端；2. 更精确的同源定向修复（HDR）途径：使用同源DNA模板进行定向基因转换。因此，通过非同源末端连接可以在特定的位点上产生随机突变；或者用带有目标DNA的供体质粒，利用目标基因两侧的同源臂通过同源定向修复（HDR）过程在切割位点直接插入目标序列。
CRISPR组分也被配置到所谓的主动遗传系统中，以利于所需性状的遗传，并可能改变昆虫、哺乳动物和其他种群。这种基因驱动系统由编码gRNA的“DNA盒子（DNA cassettes）”组成，能靶向gDNA确切插入位置。在杂合子动物的生殖系中，原始染色体的位点特异性切割导致这种“基因驱动盒子”被复制到受体的染色体上，导致其超孟德尔传递。因此，“基因驱动”具有在目标群体中迅速传播的能力，并可用于修饰或抑制昆虫载体。
基因驱动原理的一个变体被称为“等位基因驱动”，增加一个附加的、针对不同于第一个插入位点的另一个位点的gRNA。这种gRNA可以以等位基因特异的方式设计，以促进抗切割等位基因的传播，而牺牲切割敏感等位基因在同一位点上的传播。这一策略的原则证明是在果蝇对于缺口轨迹(15).当与表达Cas9的转基因结合时，等位基因驱动产生了很高的等位基因转化率，导致抗切割等位基因的超孟德尔遗传。这项研究还提出了一种类似且同样有效的方法，称为“复制嫁接”，它有利于在抗切位点附近（而不是在）等位基因变体的传递。
基因驱动和等位基因驱动都依赖于在Cas9诱导的位置特异性切割后从同源染色体复制遗传物质。这种HDR介导的DNA修复过程在生殖系中是高效的，但通常认为在体细胞组织中是无效的(17).在最近的一项研究中，我们通过证明多千碱基基因盒的同源复制可以在大鼠的体细胞中高效地进行果蝇(18).这些被称为“跟踪器”的转基因盒式磁带被设计用来揭示这种体细胞基因在几个不同的基因座上的转化事件。靶向Cas9依赖性切割后，复制者以出乎意料的高频率（30%到50%）复制到受体染色体上。这种Cas9诱导的同源修复过程也可以在人类细胞（尽管效率较低）和小鼠胚胎中得到证实，且剂量增加了Rad51(18,19).
在本研究中，我们首先提供了一个深入的分析体细胞同源染色体模板修复（HTR）的突变等位基因白色轨迹果蝇.测试的不同等位基因组合显示，通过HDR、NHEJ或通过在白眼突变背景下产生红色色素细胞克隆，这些事件的组合显示了成功的修复结果。接下来，我们意外地发现，Cas9 nickase变体D10A和H840A产生了靶向单链断裂（SSB），而不是DSB，也引发了HTR，并且其水平高于Cas9。如期而至(20)D10A和H840A诱导的NHEJ突变很少。这些Cas9和Nickase诱导的HTR策略依赖于引入少量的遗传成分，并利用细胞机制利用内源性模板将基因改变还原为野生型功能状态。基于HTR的方法可以开发出替代的基因治疗方法来纠正引起DNA改变的显性或反式杂合子疾病。
结果
等位基因特异性DNA断裂诱导HDR和NHEJ修复事件
在目前的研究中，我们评估了X-连锁的同源等位基因转换白色(w)体细胞中的位点。我们设计了多种结构，其中等位基因特异性的DNA断裂导致表型可见和可量化的修复事件，从而恢复HDR或NHEJ途径引起的红眼色素沉着(图1A).一个先前被证实的转基因是的逆时针方向基因驱动元件插入黄色的(是的)轨迹产生gRNA(白色-第三外显子的靶向切割w基因（位于~2.4 Mb或~1.5厘摩根，来自是的并在整个研究中使用[图1A以及(21)].
图1.靶向DSB后的体细胞HDR和NHEJ修复w不同程度地揭示了w+
克隆果蝇.(A)Cas9诱导的等位基因校正w.这个是的逆时针方向元素对白色-与本研究相关的gRNA，靶向切割敏感（CS）w?等位基因。功能性抗切割等位基因（CR+)结合自动液位计?同源染色体上的突变（上游约3.7kb）可作为修复模板，产生功能性ATG+CR公司+组合，生产w+克隆。CS2?（但不是CS1?)等位基因也可以通过框架恢复来修复。(B)CS和CR等位基因序列。gRNA结合位点（蓝色），PAM位点（粉红色），在CS1帧中?（12nt删除），和移码CS2?（1-nt插入）等位基因。功能CR+等位基因与l-o-f CR?等位基因（切位点分别为3和8-nt缺失）与ATG结合?突变。(C)Cas9诱导的克隆表型揭示了HTR、NHEJ和联合事件。缺乏Cas9的控制苍蝇无法修复。是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/是的+ wATG+CS1?;vasaCas9雌性显示大的实心红色克隆（矫正HTR）。同源CR?女性(是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司?/ATG+CS1?，非校正HTR）没有显示红色克隆。是的逆时针方向 wATG+CS1?/是；缺乏同源X染色体的Cas9雄性没有显示红色克隆（非再生NHEJ），而CS2?同源物种显示流行的红色克隆（框架恢复性NHEJ）。CR公司+/CS2?女性表现得更多w+克隆（来自NHEJ和HTR）比CS1?同源词。CR公司?/CS2?雌性（恢复性NHEJ）显示较少的红色克隆（仅由NHEJ依赖的帧恢复产生）。比例尺，100μm(D)HTR和NHEJ事件的量化。CS2的Cas9依赖性修复较高?（HTR+NHEJ）比CS1?雌性（仅HTR）。是的逆时针方向 wATG+CS1?/是；Cas9雄性没有修复，而是的逆时针方向 wATG+CS2?/是；Cas9雄性显示高水平修复（NHEJ依赖的框架修复）。P非成对参数化的值t测试分析：****P<0.0001。条形图表示平均值和标准差。
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此外，我们还创建了一套“测试”w?等位基因，具有特定的特征，可以通过产生红色来可视化修复事件(w+)眼睛克隆w?背景。这些功能丧失（l-o-f）w?突变是通过两个表达gRNA的结构体（5′或3′gRNA）与Cas9的瞬时来源共同注入到w+胚胎。这些w?试验突变位于（25～30nt）5′或3′附近白色-gRNA切割现场(图1B但对DNA裂解仍然敏感[因此被称为切割敏感（CS）]，并且可以通过HDR或NHEJ过程进行修复。两个等位基因，CS1?（帧12nt删除）和CS2?（1-nt帧移位插入）被选择来进行下面描述的实验(图1B).第二组突变是通过结合是的逆时针方向元素和Cas9的来源w+/+苍蝇。DNA在w在两条染色体上，NHEJ修复产生功能性或非功能性抗切割（CR+和CR?)F2代中恢复的等位基因（见图1B图S2为所有恢复的CR等位基因）。携带这些突变的染色体充当了受保护的“供体”，因为它们不再对Cas9切割的DNA敏感，但可以提供同源模板来修复切割的同源等位基因。最后，我们生成了一个w?突变删除ATG翻译起始位点，该位点位于白色-gRNA切割现场(图1B).这个自动取款机?突变与任何一个抗切割的CR结合+或CR?突变和是的逆时针方向插入(图1B)利用Cas9介导的等位基因转化。后一种组合的结果是w?供体染色体(是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+和是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司?)允许对预期导致w+在其他地方克隆w?背景(图1A).
我们看到了由Cas9驱动的CS1修复?杂交等位基因wATG+CS1?/是；瓦萨卡斯9雄性[在体细胞中广泛提供Cas9(22)]与是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+女性。F1雌性后代始终显示出大小不等的红色小眼片（见图1，C和D，图S3为一系列分级表型）。这些Cas9依赖表型表明DNA在白色-gRNA切割位点发生率高，推测导致CS1的转化?至CR+复制CR+同源染色体上功能等位基因的完整ATG+启动密码子。我们通过检查来自是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司?/wATG+CS1?;瓦萨卡斯9/+F1雌性，其中切割抗性供体等位基因无功能（CR?).正如所料，这些动物的眼睛完全是白色的（非矫正性高密度脂蛋白；图1C).因为CS1的修复过程的结果?完全取决于CR供体等位基因（CR）的性质+：红色克隆；CR公司?：缺少红色克隆），我们得出结论，HTR是唯一的生产工艺w+当供体等位基因功能正常时克隆（CR+).我们还研究了是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/wATG+CS女性和观察到的高频率w+个体（~40%，接近最大理论50%值），表明Cas9依赖的等位基因转换在雌性生殖系中也能有效地产生功能性ATG+CR公司+等位基因（图S4）。
分离Cas9诱发的NHEJ事件
为了探索NHEJ通路在我们的系统中的活动，我们制造了是的逆时针方向插入与CS相结合?Cas9存在时的等位基因。在这种缺少第二条X染色体的半合子动物中，只有基于NHEJ的修复才能在DNA切割后进行。我们发现基于NHEJ的修复发生在这些动物身上，但是修复表型取决于哪个CS?检测等位基因。而男性携带CS1?等位基因完全白眼，同源CS2?动物展示了许多红色的克隆体(图1C，底部）。因为CS2?等位基因是一种移码突变，由靠近白色-gRNA剪断位点，我们假设一部分NHEJ突变事件可能恢复正确的阅读框架，可能导致功能性w+克隆（帧恢复性NHEJ）。相比之下，CS1?等位基因是一个在框12nt缺失消除四个必需氨基酸。这种突变不适于通过NHEJ途径产生的突变事件来恢复功能，这与所有显示纯白眼睛的苍蝇一致(图1，C和D).我们通过对个体进行测序，证实了这种“框架恢复”假说w+和w?F2后代是的逆时针方向 wATG+CS2?/是；Cas9/+雄性。w+F2动物（约占整个后代的三分之一）持续显示DNA损伤恢复了正确的阅读框架，而在它们的w?兄弟姐妹没有（图S5）。
综上所述，等位基因特异性DNA切割w导致可见和可量化的红眼克隆，可归因于HDR利用同源染色体的抗切割序列作为修复模板，这一过程我们称之为HTR（在CR中+/CS1?;Cas9/+雌性），或NHEJ（CS2中?/是；Cas9/+雄性）。此外，在携带CS2的女性中?等位基因(图1C，右上角），HDR和NHEJ驱动的维修都可能导致w+克隆。与后一种推断相一致w+CS2的克隆?等位基因显著高于CS1?等位基因，其中w+克隆仅来自HDR(无花果。1天和2B).我们注意到额外的gRNA(是的-gRNA）表示是的逆时针方向构造目标黄色的轨迹（用于该结构的初始插入，见材料和方法）对修复过程没有显著影响w（图S6）。
图2.D10A诱导高水平HTR，由密集的红色小克隆阵列和序列分析显示。
(A)D10A诱导的划痕后的克隆眼表型w切割敏感型自动液位计+CS1?（顶排）或ATG+CS2?等位基因（下排），结合是的逆时针方向元件和功能抗切割自动液位计?CR公司+ w?等位基因（左），无功能的ATG?CR公司?等位基因（中间），或缺乏供体染色体（男性，右侧）。恢复w+功能表现为密集的小色素阵列w+阻断绿色荧光蛋白荧光的克隆（可见于w?未矫正区域）由vasaCas9插入提供。在雌性，D10A诱导的HTR纠正了CS1?和CS2?使用CR+顺序（纠正HTR）但不是CR?序列（非校正HTR）。CS2的低水平NHEJ依赖性修复?雌性产小w+克隆（框架恢复性NHEJ，底部中间）。同样，CS2?/Y型男性显示罕见的恢复性NHEJ（右下角图像），而CS1?无法更正（非还原性NHEJ，右上角图像）。(B)Cas9与D10A诱导的等位基因修复的整体图像量化。总色素表面积由图像量化。校正百分比计算为（色素沉着面积）×100/（眼睛总表面）。D10A诱导的修复明显高于Cas9?（46%对22%）和CS2?等位基因（66%对38%）。维修CS2?等位基因（38%）高于CS1?等位基因（22%）。在男性，频繁的NHEJ只修复CS2?与CS2低水平（1.5%）相比，在Cas9雄性中观察到约31%?/是；D10A雄性。(C)显示CS1校正的DNA序列色谱图?等位基因。参考文献w+DNA序列接近白色-gRNA显示在顶部。右边的插图显示了（D）中分析的放大图（用星号表示的量化峰）。(D)CS1的HTR定量估算?至CR+通过桑格测序。使用标记的双峰，计算三到五个个体（每个个体两个读数）的校正百分比****P<0.0001***P<0.001和**P<0.01。
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D10A nickase支持有效的等位基因转换
Cas9D10A-nickase（以下简称D10A），缺乏RuvC催化结构域的活性(三)，只切割目标DNA链（与gRNA杂交的链）以生成单个ssb。利用外源DNA修复模板，nickase已成功地用于哺乳动物细胞的基因编辑。尽管这种基因编辑的效率通常低于Cas9，但nickase产生的突变事件要少得多(20).因此，我们想知道SSB是否也能促进靶向等位基因的HTR。在上述实验中，我们是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/wATG+CS1?;D10A/+母的。出乎意料的是，这些个体表现出强烈的修复表型，其中大部分眼睛表面出现色素沉着(图2A，左上角）。相反，是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司?/wATG+CS1?;携带无功能CR的D10A/+雌性?供体等位基因表现为完全白眼（中上），且仅为罕见的一分钟w+的克隆是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司?/wATG+CS2?;D10A/+动物（中下部），与同源染色体上出现的抗切割等位基因作为修复模板的预期一致。不像Cas9诱导的w+克隆呈现在图1D10A诱导的克隆体体积小，形状各异，在眼睛表面呈高密度盐和胡椒色分布?和CS2?等位基因(图2A，左）。
对比模式w+由完整的Cas9和D10A-nickase产生的克隆表明，D10A诱导的DNA修复发生在发育的后期，与Cas9相比具有潜在的更高的效率。在荧光显微镜下对这些镶嵌的眼睛进行检查，发现了DNA修复的模式，其细胞分辨率高于明亮的场照明，由于绿色荧光蛋白（GFP）荧光（由于vasaD10A插入的3XP3-GFP标记的眼睛特异性表达）在w?但被眼睛色素吸收的部位w+克隆（图S7）。而Cas9产生的克隆表现为大的实心黑色部分，而D10A产生的表型则表现为散布在整个眼睛表面的密集的黑色小克隆阵列(图2A，左图和图S7）。D10A与Cas9诱导的成功HDR事件发生的后期发育窗口不能归因于不同的表达谱，因为这两种核酸酶都是在同一控制下表达的瓦萨发起人。相反，不同的克隆拯救模式很可能反映出不同的机制和/或修复过程的时间。
D10A尼卡斯引发的NHEJ事件很少
DNA缺口可以很容易地通过结扎修复，很少产生NHEJ介导的损伤。我们用雄性来测试D10A在我们的系统中是否有任何诱变活性，在这种情况下，同源X染色体的缺失只会导致NHEJ修复能够恢复w+对D10A引起的CS2缺口作出反应的功能?等位基因。我们确实想象过w+CS2中的克隆?/是；与Cas9诱导的修复表型相比，D10A雄性大鼠非常小，非常罕见（每只眼睛有8到25个小克隆），大部分表面都是白色的(图2A，右下角）。相反，没有w+克隆在y逆时针方向 wATG+CS1?/是；D10A动物(图2A，右上角），与CS1的观察结果一致?等位基因不能通过NHEJ突变事件恢复功能(图1，C和D).
D10A比Cas9更有效地诱导等位基因矫正
由于它们的对比模式（大克隆区与分散的小克隆），Cas9-和D10A诱导的HDR表型难以定量比较。我们使用一种基于图像的量化方法解决了这一困难，在这种方法中，通过分析在GFP通道中获得的多幅眼睛图像，可以对色素区域进行全局量化并估计整体修复百分比。该分析显示，D10A诱导的SSB导致CS1的校正百分比显著高于Cas9（约22%）?等位基因，只有HDR事件能够恢复w+功能(图2B).D10A引起CS2缺口?等位基因的修复率更高（约66%）。与CS1的区别?等位基因不能仅仅归因于NHEJ修复的贡献，在wATG+CS2?/是；D10A雄性(图2B).我们得出结论，CS1的位置（相对于切割位置的5′与3′）和性质（1-nt与12 nt变化）的差异?和CS2?等位基因影响修复结果。需要进一步分析，以确定校正等位基因的位置和性质如何影响HTR的效率。
Cas9与D10A编辑事件的验证性分子分析
我们通过对包含白色-个体果蝇的gRNA裂解位点，其中的DNA裂解是由Cas9或D10A产生的。控制杂合子蝇（CR）的DNA序列色谱图+/CS1?)显示了预期的高度相似的重叠峰，正好从CS1开始?12 nt删除断点。在Cas9存在下，与供体（CR）相对应的峰+)序列显示持续较高(图2C)，以牺牲接收序列为代价（CS1?).对6到10个独立阅读序列的定量分析表明，校正值从对照果蝇的~2%提高到表达Cas9的果蝇的~30%，这与色素沉着分析一致(图2B).在表达D10A的果蝇中，这种增强更为明显，平均校正约52%，再次表明SSB后的修复比Cas9诱导的DSB更频繁的HTR(图2D和表1).在表型定量方面，校正CS2?等位基因甚至比CS1更有效?Cas9和D10A的平均值分别为53%和59%。供者等位基因切割位点的3-nt缺失也在CR的色谱图中占主导地位+/CS1?;D10A个体，正如高比例的HDR事件所预期的那样。这一特征在CR中很难识别+/CS1?;Cas9动物，其中大量的NHEJ事件可能隐藏了这种效应。这些结果也表明，HTR发生在整个发育中的身体，而不仅仅局限于眼睛组织。与体细胞组织中的这些结果相比，我们发现D10A并没有在生殖系中诱导有效的HTR，这表明特定的体细胞因子/过程可能决定Nickase诱导的HTR的成功（图S8）。
核酸酶：类型
解理 | 体细胞HTR | 生殖系修复
F2可见 | NHEJ公司 | 发展的
时机 | 千分贝
插入
复制 | 修理后
双等位基因
解理 | 配对-
独立的
修理 |
|---|
| 案例9:DSB | 是的
（中等） | 高水平 | 高水平 | 早期（大型
克隆） | 是（中等） | 没有或很少 | 未检测到 |
|---|
| D10A：单边带 | 是的
（高效） | 非常低的水平 | 非常低的水平 | 迟到（小
克隆） | 低水平 | 是（高效） | 是（中等） |
|---|
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表1.Cas9和D10A诱导等位基因修复的比较研究。
修复的关键方面包括：断裂类型、体细胞和生殖系HTR、体细胞NHEJ、修复发育时间、多碱基插入复制、双等位基因切割后修复和配对独立修复。
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D10A与H840A修复效果对比分析
我们通过比较DSB或nicks靶向相反DNA链后HTR过程的相对效率，进一步进行了我们的分析。在这些实验中，我们使用三个同等的转基因盒插入同一个位置，以相同的水平表达Cas9、D10A或替代的H840A nickase来修复CS1?等位基因(23).H840A在HNH催化结构域发生突变，因此在D10A裂解的DNA链上产生SSB。色素沉着表型显示H840A也产生与D10A相似的HTR表型。然而，H840A在恢复方面始终比D10A更有效w+CS1的基因功能?等位基因（分别为61%和45%），而Cas9的校正率较低（20%；图3，A和B).与此表型评估一致，深度测序分析显示H840A nickase，它在我们的系统中切割转录链(图3A)，导致HDR水平显著高于D10A变体切割相反的非转录链（H840A为51%，D10A为41%；图3C).如前所述，除了HDR介导的CS1等位基因修复外，Cas9裂解还产生了很大比例的NHEJ突变事件（约33%）?等位基因（~27%；图3、C和D).这些等位基因大多由1～83nt的缺失组成，主要位于gRNA断裂位点的3′侧。大量的显性缺失表明它们可能是通过θ介导的末端连接通过微同源性依赖机制产生的(24).正如预期的那样，Nickases诱导的NHEJ突变很少（~0.4%），少数恢复事件主要是由D10A引起的切位点3′缺失和H840A依赖性nicking引起的切割位点5′缺失（图S9）。对于这两个nickase来说，有很大一部分（约20%）的CS等位基因保持不变，而Cas9几乎转化或突变了所有CS1?等位基因，不到1%的基因保持不变(图3D).
图3.Cas9-、D10A-和H840A诱导修复表型的比较。
(A)Cas9，D10A和H840A核酸酶在vasa启动子的控制下从三个相同的插入点（在X染色体位点）表达黄色的)用于诱导等位基因修复是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/是的瓦萨卡斯9 wATG+CS1?,是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/是的vasaD10A wATG+CS1?，和是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/是的瓦萨赫840A wATG+CS1?女性。对照组动物是的逆时针方向 w自动液位计?CR公司+/是的+ wATG+CS1.左图显示典型的修复表型，右边的图表显示了每种不同核酸酶的切割或刻痕。(B)等位基因修复用ImageJ进行图像分析。Nickases比Cas9更有效地诱导HTR，H840A比D10A更有效地修复CS1?等位基因。(C)CS1高温气冷堆的定量分析?等位基因深度测序。对每种基因型（无核酸酶对照CR）绘制了5个独立读数的校正后校正百分比（见材料和方法）+/CS1?、+Cas9、+D10A和+H840A）。结果证实了用色素和Sanger序列分析计算的趋势：D10A修复的修复率（41%）明显高于Cas9修复（27%）。H840诱导修复（51%）明显高于D10A***P<0.001和*P<0.05。(D)深度序列分析的饼图表示。颜色编码粉红色，捐赠者CR+等位基因；白色，完整的CS1?等位基因；深紫色，NHEJ突变（集中在切位点）；灰色，PCR诱导的重组#1和一些不对称的HTR和NHEJ事件（仅适用于Cas9、D10A和H840样品；见图S9）；浅蓝区，PCR诱导重组#2；浅紫色区，PCR诱导的替换。这种表示允许在Cas9-、D10A-和H840依赖性解理之后对不同类型的事件进行全局可视化w自动液位计?CR公司+/是的+ wATG+CS1?个人。与Cas9相比，Nickases更有效地产生HTR，其中H840诱导的转化率最高。Cas9诱导高水平的NHEJ事件，而D10A和H840只诱导低水平的NHEJ，并留下约18-23%的完整CS1?等位基因。
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Nickase诱导的HTR在转录活性较高的组织中升高
上述实验分析从整个成年动物身上获得的序列。我们通过比较表达Cas9、D10A或对照的动物不同器官和组织中Sanger测序评估的HTR过程效率，探讨了不同器官之间修复的潜在差异（图S10）。我们发现，对于D10A，HTR的最高水平出现在肠道和马氏管（约70%），组织中w该基因在整个成年期从第三龄幼虫期高度表达[(25,26)以及https://flybase.org/cgi-bin/rnaseqmapper.pl？dataset=touches_stranded&xfield1=FBgn0003996].相比之下，头部、眼睛和尸体的修复没有增加w在较低水平上表达。相反，Cas9诱导的HTR在肠道和马氏管中没有增加（图S10）。总的来说，这些相关的观察结果表明，转录可能对SSB诱导的修复结果有积极的贡献，而不是DSB。尽管如此，即使在低表达水平的组织中也能观察到修复w，似乎没有绝对要求高水平转录来维持稳健的HTR，这表明其他因素也影响该过程的效率（图S10）。
Nickase还支持磁带拷贝，尽管效率不如Cas9
我们最近报道称之为“跟踪器”的转基因盒式磁带可以成功地复制到果蝇体细胞在其插入位置的靶向DSB。这些元素被放入一个内含子中，通过在靶向内源基因的框架中插入一个荧光报告器来产生一个功能丧失（l-o-f）等位基因。当在cis中与ATG组合时?点突变，跟踪器通过产生与DsRed荧光标记表达一致的突变表型来揭示HDR事件(18).例如，在w自动液位计?[抄送]/w+雌性表达Cas9，DNA裂解靶向完整的w+发育过程中的等位基因导致w?克隆表型，其中体细胞基因转化导致产生l-o-f纯合w[抄送]/w[抄送]克隆也表达DsRed报告者（图S11）。在w自动液位计?[抄送]/w+表达D10A的雌性，我们一直观察到很少有小的w?眼罩也表达DsRed（图S11）。我们的结论是，D10A-nickase也可以介导基因盒的体细胞复制，但在这种特殊的结构中，它的效率比Cas9要低（约5-6倍的减少），这可能是由CopyCatcher插入引起的局部失调的结果。
总的来说，我们的观察结果显示Cas9和nickase都会导致体细胞的同源等位基因校正，但它们表现出明显不同的动力学和效率(表1).HTR对Nickase诱导的SSB的等位基因变异的修复比Cas9依赖的DSB更有效。此外，与Cas9相比，nickase在发育后期起作用，不会产生突变，而Cas9是HTR与NHEJ修复途径竞争的产物。
对称遗传结构中Cas9和Nickase介导的等位基因校正
上述实验涉及等位基因特异的DNA切割，之后抗切割序列用于同源位点的定向修复。我们测试了另一种“敏感/敏感”的结构，其中w基因座受到DNA断裂的影响。对于这些实验，我们利用w1118空等位基因（称为w德尔在下文中），一个包含第一外显子和大部分第一内含子的多碱基缺失w(27)，却离开了白色-gRNA识别位点和相邻序列完整(图4A).反式杂合子w德尔/是的逆时针方向wATG+CS1?苍蝇只产生稀有的红色小克隆来回应Cas9的表达(图4B，左上），表明双等位基因DSB很少在成功恢复功能时解决w+等位基因。相反，是的逆时针方向 wATG+CS1?/w德尔表达D10A的雌性大鼠表现出频繁的表达w+克隆(图4B，左下），尽管比携带抗切割CR的同类苍蝇数量少+等位基因(图2A).这些结果表明每个等位基因(wCS1?和w德尔)可以用其他等位基因作为模板进行切割和修复。而wATG+CS1?等位基因可以用野生型同源序列修复，导致功能性w+等位基因w德尔用CS1修复等位基因?序列总是不起作用。在这两种情况下，两个等位基因对进一步的分裂仍然敏感，然而额外的复制事件通常不再改变修复的等位基因的性质（功能性与非功能性；图4，A和B).在Cas9存在的情况下，这种反复的攻击可能导致NHEJ突变的最终积累和大多数细胞中基因功能的永久性丧失。大量的存在w+克隆是的复写的副本 wATG+CS2?/w德尔;Cas9动物（其中CS2?等位基因可以通过NHEJ）恢复到功能状态，但不能在等效的CS1中恢复?苍蝇，强烈支持这个假设(图4B).
图4.等位基因修复的特殊结构：双等位基因HTR。
(A)涉及两个切割敏感（CS）等位基因的等位基因修复：ATG+反恐精英?和w德尔反恐精英+.CS劈开?等位基因与同源CS修复+序列（HDR-a）导致功能性ATG+反恐精英+组合。CS裂解+并使用CS进行维修?（HDR-b）导致无功能组合(w德尔反恐精英?).在这两种情况下，修复后的等位基因仍然对切割敏感，容易受到额外核酸酶的攻击，导致功能性或非功能性NHEJ等位基因（Cas9）或大部分保持完整（D10A）。(B)克隆的w+表型显示CS1修复?（左图）和CS2?（右图）Cas9（上图）或D10A（下图）等位基因。当两个等位基因对切割敏感时（CS1?/CS公司+)，Cas9依赖性劈开导致很少的修复（左上图）。相反，CS2?/CS公司+表达Cas9的果蝇表现出更大的修复，表明CS2的NHEJ框架修复作用显著?.对于表达D10A的动物，两种CS1?/CS公司+（左下角图像）和CS2?/CS公司+（右下角图像）显示相似的修复表型，由许多小的w+克隆体，反映了主要的HTR。(C)等位基因特异性测序揭示CS1中的HTR?/CS公司+基因型（顶图）。位于起始密码子的前向引物确保了ATG的选择性扩增+等位基因。对照组动物（无核酸酶，顶层色谱图），只有CS1?序列被放大。星号表示（D）中用于定量分析的峰值。继Cas9诱导DSB（第二次电泳）后，CS1处出现双峰?删除断点（绿线）显示有效HTR。从切割部位开始的三倍和四倍峰值显示出高水平的NHEJ。在D10A诱导的划痕（第三次电泳图）之后，更多的不对称双峰显示出更高水平的HTR（蓝线），而在切割部位后没有检测到NHEJ。(D)CS1等位基因特异性测序对HTR的定量分析?/CS公司+动物。每种基因型的校正百分率被绘制出来。Cas9诱导的修复（约12%）明显低于D10A诱导的修复（约36%）****P<0.0001和**P<0.01。
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我们通过对对照和基因编辑的果蝇进行序列分析，进一步描述了双等位基因切割/刻痕后的HTR事件。我们通过选择性聚合酶链反应（PCR）扩增的方法检测和定量了HTR事件wCS1?等位基因使用引物退火到ATG起始密码子区域（不能从w德尔等位基因，因为它缺乏ATG起始密码子和周围的序列）用于这种选择性扩增(图4C).对这些PCR产物的序列分析只显示了预期的CS1?控制中的12 nt删除w德尔/wATG+CS1?苍蝇(图4C).相比之下，表达D10A的类似果蝇的读数显示出与野生型和CS1重叠的双峰?等位基因和揭示等位基因修复的频繁实例(图4C，底部）。对这些Sanger测序数据的量化显示修复率约为36%(图4D)正如预期的那样，这低于先前实验中52%的校正估计值，这些实验涉及使用抗切割供体等位基因和相同的D10A源进行定向修复(图2D).相反，w德尔/wATG+CS1?;Cas9动物的矫正水平很低（约12%；图4D)高水平的NHEJ诱导的突变在切割部位可见三倍和四倍的峰值(图4C，中间一行）。这些观察结果与我们提出的敏感/敏感配置机制是一致的：每个等位基因都可以被另一个等位基因取代，从而导致两个等位基因的纯合状态（CS1?或CS+).因为这些等位基因都对切割敏感，所以它们仍然是进一步切割/刻痕的目标，除非NHEJ产生抗切割（和可能）的非功能等位基因。后一种结果在Cas9患者中很常见，但在D10A患者中很少见，这得到了眼部表型和序列分析的支持(图4，A和D).
等位基因校正不需要长期稳定的染色体配对
以上检查的所有修复过程都涉及到同源染色体上的等位基因的复制。这些事件很可能是由长程染色体配对所促成的，这种现象在多细胞生物的生殖系中是非常重要的，但在双翅目动物的体细胞组织中也很普遍，这是遗传转化等现象的基础(28–30).同源配对被认为在典型的哺乳动物细胞中很少见，但在一些癌细胞系中也有报道，并且可以由DSBs局部诱导(17,31–33).
我们检测了在没有体细胞染色体配对的情况下，等位基因修复是否也可能发生果蝇系统使用现有的转基因携带微型-白色当插入不同的染色体位置时，导致不同眼睛色素沉着表型的cDNA。插入是根据它们产生的浅色眼睛颜色来选择的（当放置在w?/?背景），这样修复事件可以区分为暗红色的克隆体，与黄色或橙色背景形成对比。是的逆时针方向 wATG+CS1?/Y个人携带P<mini-白色+>插入(图5A)检测SSB（D10A）或DSB（Cas9）诱导的克隆表型。在没有任何核酸酶的情况下，眼睛呈现均匀的橙色，这是由于完整的mini的表达-白色+P元素标记基因。携带Cas9来源的个人展示w?覆盖了相当一部分眼睛的克隆体(图5B，左中），大概反映了P<mini-白色+>序列已经针对DSB并通过容易出错的NHEJ途径修复。当在相同的遗传背景下对D10A尼克斯进行分析时，我们反而在眼睛表面发现了许多红色的小克隆(图5B，右中）。D10A诱导的修复频率从2%到14%不等(图5C以及图S12）。因为我们使用了帧内删除CS1?等位基因在这些实验中，观察到的功能修复只能归因于HDR，而不是影响P<mini的替代突变过程-白色+>插入。当w[德尔]用等位基因（不能通过等位基因校正恢复到功能状态）代替CS1?等位基因（in是的逆时针方向 w[德尔]/是；D10A/；P<迷你-白色+>/+个体），没有产生红色克隆(图5B，最右边）。
图5.配对独立等位基因修复的证据。
(A)该系统通过白色+克隆表型，其中修复模板（携带迷你-白色cDNA）是在D10A诱导的缺口后，从一个单独的染色体位置提供的。(B)常染色体P（mini-白色+)在其他情况下，转基因插入导致浅橙色眼睛表型w-背景（左下）。在y轴逆时针方向wATG+CS1?/是；P（迷你型-白色+)/Vasacass9雄性（第二），在P（最小-白色+)插入导致大白色?从NHEJ介导的突变中获得的克隆。在y轴逆时针方向wATG+CS1?/是；D10A/+；P（迷你型-白色+)/+雄性（第三），许多小白色+橙色背景下的克隆表明，等位基因修复是通过序列同源性，独立于染色体配对而发生的。在y轴逆时针方向 w删除CS+/是；D10A/+；P（迷你型-白色+)/+雄性（第四），这种修复是不可检测的，如w德尔无法还原到功能状态。后一个控件显示白色+y中的克隆逆时针方向 wATG+CS1?/是；D10A/+；P（迷你型-白色+)/+动物（第三种）不会因P（mini）的任何改变而产生-白色+)序列但是修复CS1?常染色体P（mini）等位基因-白色+)序列。(C)CS1配对无关修复的定量研究?等位基因显示，D10A诱导的表型挽救率约为8%，而对照组则没有。在这些实验中，第二条染色体vasaD10A和第三条染色体vasaCas9（如无花果。1和2)被利用了****P<0.0001。
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我们还检测了另外两个常染色体P<迷你-白色+>插入它们的能力，作为这种配对独立校正的模板。我们发现由D10A而不是Cas9诱导的具有不同频率的相似小红色克隆表型（图S12），表明这种同源独立修复形式并不严格依赖于修复模板的特定基因组位置。我们的结论是，等位基因的校正可以只依赖于序列同源性迷你白色基因而不是长程染色体配对，这个过程我们称之为配对独立修复。而类似的配对独立修复在果蝇Cas9诱导的生殖系(34)或者通过P元素转置(35)目前的实验表明，这种过程也可以发生在体细胞组织中。在这些先前的研究中，不同的染色体位置和供体插入的表达水平可能会极大地影响配对独立修复的效率。
累积起来，这些不同的遗传和分子评估表明，在白色基因座在等位基因特异性或双等位基因靶向切割或刻痕后运行。与Cas9相比，非突变型D10A或H840A nickases能更有效地促进这一过程，且不完全依赖于染色体配对，尽管这种配对增加了校正频率（见表1).
讨论
在这项研究中，我们开发了一个多功能的遗传系统，在这个系统中，由Cas9或nickase产生的靶向DNA断裂引起不同的修复过程，这些修复过程由可量化的色素沉着表型揭示果蝇.我们使用了多种等位基因组合，结果表明利用同源染色体的抗切割序列作为修复模板（HTR）的HDR过程在体细胞中是出人意料的有效的。而DSB后的同源修复在果蝇生殖系(36–38)，最近才有报道(18,19)它在体细胞中的特征要小得多，在体细胞中，NHEJ通路被认为占主导地位，并在整个细胞周期中运作以修复DNA断裂(8).
我们研究中最显著的发现是，两种来源于Cas9的突变核酸酶D10A和H840A维持着较高的体细胞等位基因转化率（45-65%），超过Cas9的观察值（约30%）。这种Nickase诱导的SSB修复模式与Cas9诱导的DSB修复模式明显不同。与Cas9相比，Nickases产生的NHEJ突变要少得多，并且在发育的后期启动HTR，这一点从较小的克隆大小和更高的克隆数中可以看出。D10A可以维持多千碱基插入的体细胞复制，但其效率远低于Cas9（其等位基因修复活动的相反；图S11）。此外，D10A只支持抗切割等位基因的低水平生殖系复制，而Cas9则以很高的效率这样做（总结见表1).
考虑到先前对DSB和SSB修复机制的了解，可以解释Nickase与Cas9活性的显著差异。dsb可以通过突变的NHEJ或HDR来修复，这包括从姐妹染色单体复制（在S和G2或来自同源染色体（在所有阶段或细胞周期中）。这两个过程都会产生不可折叠的序列（NHEJ诱导的突变或从同源染色体复制抗切割等位基因），这样在最初几个修复周期之后就提前到达终点，产生大的固体w+和w?我们系统中的克隆。相比之下，DNA缺口通常是通过直接修复来精确修复的(39,40)，从而恢复一个完整的切割位置，然后可以反复刻痕。因此，重复的刻痕和修复周期很可能发生，直到有利于或需要HDR的条件出现，其中来自同源染色体的抗切割序列的复制终止了这个循环过程。
可能促进缺口诱导的HDR的两个潜在过程是转录和复制，这两个过程都有利于相反链上第二个缺口的发生。在这种情况下，将两个单边带并列在相反的绞线上可能会产生有效的具有不同尺寸悬垂的DSB(39,40)，然后可以通过标准或替代的HDR过程进行修复。我们观察到D10A诱导（而不是Cas9诱导）的HTR与升高之间的相关性白色在消化和分泌系统中的表达（图S10），支持转录有利于SSB到DSB转变的模型(41,42).在复制过程中，由拓扑异构酶产生的缺口，需要释放过卷产生的应变(43)当在nickase诱导的ssb附近产生时，也可能分解为DSB。另一方面，冈崎碎片之间的连接点附近或施加在单链间隔上的物理应变也可能导致二次断裂事件。与Cas9诱导的dsb不同，Nickase间接产生的dsb发生的速度可能慢得多，这可能是Nickase诱导的修复与Cas9诱导的修复相比发育时间延迟的原因。这种对比动力学也可以解释NICKASE诱导的NHEJ突变事件发生率（约0.4%）远低于Cas9（约30%），因为在NHEJ（快速修复）和HDR（慢速修复）之间的选择可能会受到DSB生成速率的影响。
先前的机制和遗传学研究表明，由nicks诱导的HDR要么通过典型的Rad51和BRCA2因子发挥作用，要么通过一个有效的Rad51独立途径发挥作用(44).在这项研究中，刻痕转录的DNA链比刻痕编码链导致更高水平的修复，我们的系统也观察到了这一点(图3)在相反的DNA链上产生两个刻痕则产生高效的HDR(45).此外，RecQ5A解旋酶水平的增加有利于向这一替代途径的转变(46).在波姆裂殖酵母以姐妹染色单体为修复模板的缺口诱导HDR在PNKP中显示?（多核苷酸激酶磷酸酶）突变体。PNKP活性的缺失阻止了直接释放，促进了Rad51独立的HDR途径(47).另一个例子已经在鸟类中被证明，伪基因模板化的基因转换对于产生免疫球蛋白多样性是必不可少的，并且是由轻链位点V段的DNA缺口引起的(48,49).这些在从酵母到人类的体细胞真核细胞的缺口处诱导高密度脂蛋白受体的例子表明，这些过程依赖于广泛保守的修复机制。我们的等位基因修复系统果蝇该方法灵敏、定量，可用于筛选RNA干扰和错表达株，以确定Cas9或Nickase诱导HTR的关键保守因子。
双翅目昆虫的染色体与哺乳动物的染色体不同之处在于它们进行广泛的体细胞配对(17,31,50)在生殖系和体细胞组织中，如转基因现象所示，其中来自一个染色体的调节序列促进同源染色体编码序列的表达(28–30).因此，这种体细胞染色体配对有望在促进我们系统中观察到的HTR中发挥重要作用。然而，我们发现，当同源供体DNA来自不同的染色体位置时，nick诱导的HDR也可以操作，尽管效率降低。在昆虫生殖系中已经实现了类似的配对无关的基因转化，其成功与否在很大程度上取决于供体和受体序列各自的染色体位置(34,35).在哺乳动物细胞中，只有少数同系物修复的例子被报道。例如，Cas9诱导的DNA断裂可以导致基因盒定向复制到人HEK293T（人胚肾293T）细胞的同源染色体上(18)当过量提供Rad51时，小鼠胚胎中抗切割等位基因的纯合性(19).这种现象可能会受到在dbs之后观察到的局部同源配对的支持(32,33).
基于CRISPR的基因编辑为基因治疗提供了巨大的希望。然而，许多报告对依赖于Cas9的大量缺失的产生及其潜在的有害的非目标活动提出了担忧(51,52).正如在各种脊椎动物和无脊椎动物系统中广泛记录的那样，nickase提供了一个理想的特性，即比Cas9引起的NHEJ产生的突变和非靶向效应要少得多(20,44,49,53).因此，nick诱导的HTR为此类治疗应用提供了一种安全有效的方法。上述研究结果表明，在nicks处的同源HTR也可能在哺乳动物系统中实现。因为脊椎动物的染色体对通常被认为在不同的染色体区域保持分离(17)许多研究表明，包括DNA荧光原位杂交和Hi-C分析(54–56)，哺乳动物细胞和组织中的HTR可能需要进一步的优化果蝇达到理想的效率。例如，在我们的研究中，CRISPR组件在数天内缓慢连续交付可能比一次性交付方法更为有益。此外，我们在这里描述的配对无关的等位基因转换模式可以作为一个很好的模式，以加强尼克诱导的等位基因校正在苍蝇和哺乳动物系统。如果可以通过促进同源配对或优化缺口特异性修复过程来增加此类事件的发生频率，那么这些策略就可以用来纠正大量显性或反式杂合子致病突变。
