钙调素介导的真核细胞延伸因子2激酶激活的结构基础

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【字体：大中小】 时间：2022年07月08日 来源：AAAS

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　　翻译是一个严格调控的过程，它确保了最佳的蛋白质质量，并能适应能量/营养素的可用性。α-激酶真核细胞伸长因子2激酶（eEF-2K）是翻译的关键调节因子，它特异性地磷酸化鸟苷三磷酸酶eEF-2，从而降低其对核糖体的亲和力，抑制蛋白质合成的伸长阶段。

摘要

翻译是一个严格调控的过程，它确保了最佳的蛋白质质量，并能适应能量/营养素的可用性。α-激酶真核细胞伸长因子2激酶（eEF-2K）是翻译的关键调节因子，它特异性地磷酸化鸟苷三磷酸酶eEF-2，从而降低其对核糖体的亲和力，抑制蛋白质合成的伸长阶段。eEF-2K的激活需要钙调素结合和初级刺激位点T348的自磷酸化。生化研究预测了钙调素介导的eEF-2K活化机制，不同于其他钙调素依赖激酶。在这里，我们通过钙调素异二聚体复合物和eEF-2K（eEF-2K）的功能核心的2.3-挈晶体结构来解析这一机制的原子细节_TR公司).这个结构代表了eEF-2K活化的T348磷酸化状态_TR公司，强调了激酶与钙调素C叶的密切联系，形成了一个“激活脊椎”，通过保守的调节元件将其氨基末端钙调素靶向基序连接到其活性部位。

简介

真核生物的蛋白质水平主要受mRNA翻译的控制(1)，一个耗资巨大的过程(2)这是高度监管的(三)确保蛋白质质量控制的最佳转运时间(4)以及形成细胞对环境压力和能量和/或营养素可用性变化的反应(5).这种调节的一个主要驱动因素是特定的磷酸化（在Thr上⁵⁶)在鸟苷三磷酸（GTP）依赖性转位酶中，真核细胞伸长因子2（eEF-2）。这种共价修饰，由非典型激酶eEF-2激酶（eEF-2K）唯一催化(6,7)，降低eEF-2与核糖体结合的能力，抑制蛋白质合成的伸长期(8,9).eEF-2K活性的失调与神经系统疾病如老年痴呆症有关(10)帕金森氏症(11).eEF-2K功能异常与肿瘤的发生有关(12)侵袭和转移(13).鉴于这些特性，eEF-2K是治疗多种疾病（包括许多癌症）的新靶点(14–16)以及神经病变(17)强调了了解其激活和调节机制细节的重要性。

α-激酶家族成员(18,19)其中包括eEF-2K，与构成真核细胞kinome树分支的“常规”激酶的序列相似性较差(20).在复杂的真核生物中广泛分布，脊椎动物和无脊椎动物编码不同的α-激酶。eEF-2K是这个家族中唯一一个在脊椎动物和无脊椎动物中都出现的直系生物，表明了它在这个家族进化史上的地位，并强调了它在调节基本细胞过程中的作用。eEF-2K是唯一依赖钙调素（CaM）的α-激酶，这一事实也突显了eEF-2K的独特性(6)用于激活。eEF-2K的激活被认为是通过变构过程发生的(21)由其与CaM的相互作用介导。凸轮装订增强了外观k_猫在没有显著改变亲和力的情况下，将eEF-2K向肽底物转化约2400倍。随后在初级上调位点（T348）的自动磷酸化可使k_猫，产生完全激活状态。这种机制不同于其他依赖CaM的激酶，后者依赖于CaM诱导的自身抑制片段的位移来增强底物的通路(22).eEF-2K活性受Ca的进一步调控^二+(23)，pH值(24)，以及其他调节性磷酸化事件(25)通过多种途径，包括雷帕霉素（mTOR）、腺苷激活蛋白激酶（AMPK）和细胞外信号调节激酶（ERK）等(12).由于缺乏全长酶或其CaM结合激活复合物的结构，对eEF-2K活化和调控的深入研究受到了阻碍。我们已经确定了eEF-2K的最小功能结构，eEF-2K_TR公司(图1A和图S1），它被CaM激活，类似于野生型酶，并有效地磷酸化细胞中的eEF-2(26).利用x射线晶体学，我们解析了其T348磷酸化态的结构(peEF-2K型_TR公司)在激活的异二聚体与CaM（CaM?peEF-2K型_TR公司)数据收集和统计的详细信息见表1).在它的发现和生化特性鉴定之后将近四十年(6)，这一结构首次对CaM介导的eEF-2K激活的独特机制的原子细节提供了重要的见解。它为文献中可用的大型生化数据库的结构解释奠定了基础(23)同时有助于合理设计针对各种人类疾病的独特酶的小分子调节剂(27).

图1.凸轮结构peEF-2K型_TR公司复杂。
(A)eEF-2K（顶部）结构模块示意图，表示钙调素靶向基序（CTM；青色）、调节元件（RE；粉红色）、激酶结构域（KD；石灰绿）、调节环（R-环；深灰色）和C-末端结构域（CTD；深橙色）。eEF-2K_TR公司结构（底部）缺少70个eEF-2K的N-末端残基，一个6-甘氨酸连接体取代了R-环的359-489段。(B)凸轮结构peEF-2K型_TR公司复杂的表面（顶部）和带状（底部）表示；凸轮N形凸轮（凸轮_N)和C-瓣（凸轮_C)分别是亮黄色和暗黄色；eEF-2K_TR公司颜色与（A）中相同。(C)凸轮结构peEF-2K型_TR公司根据先前描述的小角度x射线散射（SAXS）数据计算的两个主要团簇中的一个的分子包层中的配合物，这些数据是在CaM?eEF-2K的低浓度样品上获得的_TR公司复合物（未磷酸化T348）(26).相应的实验数据（蓝色圆圈）、理论拟合（红色曲线）和简化残差（Δ/σ）如下图所示。虽然SAXS生成的包络线再现了解的整体结构特征，但减少的残差在低s值和相对较大的χ²值表示分子物种之间的差异。其中一些差异可以归因于这样一个事实，即SAXS数据是在Ca存在下获得的^二+但是在没有镁的情况下^二+.

数据收集	?
光束线	NSLS-II波束线19-ID
波长（?）	0.97946
空间组	P三₁21
单元尺寸	?
??一,b,c(?)	58.50，58.50，365.78
??α, β, γ (°)	90，90，120
分辨率（?）	121.9，2.34
?	（2.382，2.342）
R_合并	0.362（1.778）
我/σ(我)	14.5（2.5）
完整性（%）	100（100）
冗余	25.9（24.5）
威尔逊B因子	14.99
唯一反射数	32010年（1494年）
精炼	?
分辨率范围	50.66–2.34
没有。反射	31982个
R_工作/R_自由的	0.2293/0.2520
非氢原子数	?
大分子	5117个
配体	8
溶剂	144
蛋白质残基	637
均方根值（键合）（Β）	0.003
均方根（角度）（°）	0.533
拉马钱德兰阴谋	?
最受青睐（%）	91.1
额外优惠（%）	8.7
慷慨受惠（%）	0.2
不允许（%）	0
转子流量计异常值（%）	0.38
碰撞得分	4.29
平均B系数²)	35.37
大分子	35.6
配体	29.35
溶剂	27.61
PDB加入代码	7SHQ公司

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表1.数据收集和细化统计。

括号中的值用于最高分辨率的shell。R_合并=∑|(我? <我>)|/∑我，其中我是观察到的强度。

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结果与讨论

凸轮的结构peEF-2K型_TR公司复合体显示了一个加长的组件

凸轮?peEF-2K型_TR公司复合体形成一个细长的结构(图1B)这与先前对非活性络合物（未磷酸化的T348）的溶液态小角x射线散射（SAXS）测量结果一致(图1C) (26).激酶结构域（KD）具有典型的α-激酶结构，其C-叶（KD_C)拥有不变的结构锌^二+以四面体排列的离子，由H260、H312、C314和C318的侧链配位(图2A).而凸轮?peEF-2K型_TR公司在慢水解三磷酸腺苷（ATP）类似物腺苷酸亚氨基二磷酸（AMP-PNP）存在下结晶，未发现与结合核苷酸相对应的密度。然而，与相关肌球蛋白重链激酶a（MHCK-a）KD可用结构的比较(图2B，左）(28,29)允许分配eEF-2K的“催化”残留物_TR公司.R144（MHCK-A，α和β磷酸盐中的R592），K170（K645，α磷酸和腺嘌呤环），E229（E713，腺嘌呤氨基），K238（K722，水介导的γ磷酸盐识别）和Q276（Q758，催化镁）^二+γ-磷酸）代表可能与核苷酸配位的残基，D274（D756）是推测的催化碱基。如MHCK-A的核苷酸结合态(图2B，右），P和N/D循环peEF-2K型_TR公司与相关的ATP配位残基（可能除了K238外，由图2B)以正确的方向来协调核苷酸。因此，有点令人惊讶的是，在CaM中没有发现结合核苷酸peEF-2K型_TR公司复杂。

图2.结构特点peEF-2K型_TR公司在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复杂。
(A)结构锌的四面体配位模式^二+以α-激酶为特征。(B)eEF-2K关键催化残基（绿色）的取向比较_TR公司凸轮中的KD?peEF-2K型_TR公司在相关的MHCK-A KD的几种结构中具有相应残基（暗黄色）的络合物如左图所示。还显示了（浅灰色的MHCK-A残基）是文中讨论的关键N/D环残基。Mg^二+凸轮结构中的离子peEF-2K型_TR公司复合体以绿色显示，在MHCK-A结构中所见的以灰绿色显示。右图：KD的叠加peEF-2K型_TR公司在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复合物（绿色）和MHCK-A-KDs，其核苷酸结合（暗黄色）或无核苷酸结构（粉红色），相应的P-环和N/D-环分别为浅灰色和深品红。在核苷酸存在下，P环相对于N/D环的闭合构象是明显的。eEF-2K也可以看到这种闭合配置_TR公司凸轮中的KD?peEF-2K型_TR公司复杂。(C)稳定的相互作用pT348位于磷酸盐结合袋（PBP）处，并将PBP连接到活性部位。关键的催化环残基，包括D274（假定的催化基）、Q276和D284，都是供参考的。(D)涉及稳定KD/CTD界面的αE-α2′-α3′元素的关键相互作用。H527-H554δ-δ氢键用橙色虚线表示。

与MHCK-A类似，T289（MHCK-A中的T771）、N299（N781）和L300（L782）在N/D回路上的作用(图2B（左）的eEF-2K_TR公司也可以推断。N299通过与T289侧链和D294主链的氢键稳定。这种“天冬酰胺in”构象被认为是MHCK-A活性态的特征(28).在MHCK-A中，有人建议用N781和L782来确定活性位点的可及性。鉴于它们相似的空间位置和方向，类似的N299和L300在eEF-2K中的作用相似_TR公司可以设想。

值得一提的是，当eEF-2K_TR公司KD，就像相关的MHCK-A一样(28)还有查克(30)，显示了在传统真核生物蛋白激酶中所见的具有特征性的双叶折叠，结构偏差明显（图S2A）。N叶（KD）的相似程度更高_N)比KD_C，后者显示出类似ATP抓握褶皱的结构特征(31)，如前所述(30).eEF-2K的空间分布_TR公司与传统激酶相比，催化残基也是不同的（图S2B），表明其与后者有显著的差异。

如上所述，在凸轮的结构中peEF-2K型_TR公司复合物一级活化的T348被磷酸化(pT348；图S3）。pT348与磷酸盐结合袋（PBP）对接，与K205、R252和T254侧链以及L253和T254主干形成氢键(图2C).D280与R252和Y282侧链上的氢键。这种相互作用促进了I275和Y282之间的甲基-π相互作用(图2C)从而将催化中心与PBP偶联。在MHCK-A-KD的某些结构中，保留的残基D663(29)和D766(28) (图2B（左）被发现磷酸化。这些磷酸天冬氨酸物种被认为是影响活性。在eEF-2K中，我们没有发现等效残基（D184和D284）磷酸化的证据_TR公司在摄像头内?peEF-2K型_TR公司复杂。

全螺旋C端域（CTD）代表了eEF-2K独有的特性，它构成了eEF-2的对接平台(25,32).α2′-α7′区呈现典型的SEL1样重复序列(33)α8′-α10′部分偏离此排列，α1′与其余CTD部分分离。α2′稳定KD/CTD界面，与KD上的αE相互作用_C和α3′(图2D).αE-α2′界面具有疏水相互作用，其中Y533被A306和L307夹在中间，V526插入M305和L523之间。αE-α2′-α3′元素的一个奇特特征是三个保守的His残基（图S1）的线性空间定位（α2′上的H527和H534；α3′上的H554；图2D);空间上也接近H557（α3′）与H527堆叠。H554与H527形成罕见的δ-δ氢键(34).H534和H554形成盐桥，保守的E332位于螺旋R环段（αL〃）。我们很容易推测，这些His残基中的一个或多个质子化状态会通过αE-α2′-α3元素改变KD/CTD界面内的相互作用，并可能改变其与R-环的耦合，从而有助于观察到的酶的pH响应(24).核磁共振研究(32)将eEF-2对接位点定位于CTD（α9′-α10′）的C端，与活性位点相距约60°，表明不同的相互作用驱动了eEF-2的识别及其随后的磷酸化。

凸轮的C端叶在识别中起主导作用peEF-2K型_TR公司

凸轮触点peEF-2K型_TR公司在一个扩展的构象中使用它的N-（CaM_N)和C端子（凸轮_C)凸角，带凸轮_C与激酶有更密切的联系(图3A).该组件与先前氢交换质谱（HXMS）分析中看到的保护变化一致（图S4）(26,35).所有四个凸轮_C螺旋体通过其疏水表面与凸轮靶向基序（CTM）相结合^二+-肺叶的束缚“开放”构象，除α_H，与KD互动_N使用他们主要是亲水的脸。一个深的疏水袋，内衬着Ala的侧链⁸⁸（用于凸轮残基的三字母代码），Phe⁹²，伊莱¹⁰⁰，亮氨酸¹⁰⁵，已见¹²⁴，伊莱¹²⁵，瓦尔¹³⁶，菲¹⁴¹，已见¹⁴⁴，并认识了¹⁴⁵，可容纳来自eEF-2K的W85_TR公司CTM公司。I89与丙氨酸的额外疏水相互作用⁸⁸相识¹⁴⁵和带Val的A92⁹¹还有Leu¹¹²生成1-5-8绑定模式(图3B)在螺旋CTM内，如CaM与编码CTM的肽复合物的NMR结构（CTM-pep，74-100）(36).但是，没有凸轮_C-绑定Ca^二+在肽复合物中发现了离子(36).凸轮的亲水面_C与KD进行了多次接触_N在一个大的相互作用面上(图3C).在这个界面上的“虚拟丙氨酸扫描”确定了几个涉及残基的接触，这些残基的硅丙氨酸突变基本上不稳定（ΔΔG>1.5千卡/摩尔）(37).其中包括Asp⁹⁵和Ser¹⁰¹在凸轮上_C以及eEF-2K上的K192和D208_TR公司克朗；所有这些残基的侧链形成以K192为中心的氢键网（ΔΔG=2.5千卡/摩尔）。其他值得注意的相互作用包括Arg之间的氢键⁹⁰侧链和A164主链和L281 His¹⁰⁷甲基-π相互作用。这些相互作用共同定位了CTM栓系凸轮_C在激酶活性位点后面。在Asp¹²²和R351对凸轮_C到R环。相反，CaM_N似乎与peEF-2K型_TR公司在摄像头内?peEF-2K型_TR公司复杂。KD上的β6-β7-环_N与凸轮上的浅疏水槽有关_N;F155与Leu相互作用³⁹还有菲¹²，L156和Leu⁴相识⁷⁶(图3D).

图3.CaM与分子间的相互作用peEF-2K型_TR公司.
(A)凸轮和eEF-2K_TR公司分别显示在ribbon和surface表示中。凸轮的组成螺旋线_N(α_A-α_D)还有CaM_C(α_E-α_H)表示。与疏水性的相互作用(B)亲水的(C)凸轮面_C用CTM和KD_N分别举例说明。(D)凸轮的相互作用_N用KD的β6-β7-环_N.不直接参与交互的元素被隐藏以帮助可视化。

凸轮的N端叶在凸轮中采用闭合结构peEF-2K型_TR公司复杂的

对比其Ca^二+-CTM-pep复合物中的束缚开放构象(36)，凸轮_N以毫克计^二+-绑定“关闭”状态(38)订婚时peEF-2K型_TR公司(图4，A和B).据我们所知，这种构象以前从未在CaM复合体中观察到。凸轮_N通过与对称性相关的大量晶体接触进一步稳定(图4C).鉴于这种独特的构象和高镁^二+采用结晶浓度，考察了Mg对结晶的影响^二+在凸轮上_N/peEF-2K型_TR公司溶液中的相互作用。而游离镁^二+在哺乳动物细胞中保持相对恒定的约1毫米(39)，加州^二+静息细胞的浓度约为50至100nm，可提高至约100μM(40)在特定刺激下的钙微区。Ca^二+：毫克^二+用于结晶的比例（1:100）很好地在这个细胞范围内。值得注意的是，eEF-2K_TR公司在这些条件下，保留了T348上有效地自动磷酸化的能力(图4D).

图4.凸轮构型_N在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复杂。
(A)凸轮构型_N在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复合物（黄色）与镁结合^二+（橙色；PDB:3UCW）(38);相应的结合态Mg^二+离子显示为浅绿色或深绿色球体。(B)CaM的构象_N在摄像头中?peEF-2K型_TR公司在Ca存在下，与CTM-pep配合物的NMR结构（gray，PDB:5J8H）进行了比较^二+(36).凸轮_N参与peEF-2K型_TR公司以毫克计^二+-束缚闭构象而不是Ca^二+-结合开放构象如CTM-pep复合物。为了清楚起见，省略了金属离子。(C)相邻两个凸轮之间的相互作用_N晶体内部对称性相关的单位（黄色和绿色）显示为色带（左）或表面（右）。涉及α的广泛晶体接触_C和α_D（与peEF-2K型_TR公司主要涉及α上的疏水残基_A和α_B)表明这种排列方式稳定了晶格中的复合物。(D)eEF-2K型_TR公司在Ca的条件下，保持T348上有效地自动磷酸化的能力^二+至Mg^二+比例（1:100）与结晶所用的相似。用两组不同浓度的Ca测定了T348自磷酸化的时间过程^二+还有镁^二+当它们的比率保持不变时。

核磁共振分析(图5)使用凸轮的Ile-δ1和Met-ε共振（代表性光谱见图S5）表明凸轮中没有明显的扰动_C随Mg增加而共振^二+在钙存在下形成的络合物中的浓度^二+.这表明Mg^二+即使在非常高的浓度下，也不能显著影响peEF-2K型_TR公司带凸轮_C.相反，CaM_N共振显示Ca之间交换的证据^二+-还有镁^二+-Mg增加时的结合构象^二+.在一个非常高的镁^二+集中在^二+：毫克^二+比率严重偏向镁^二+在静止细胞中，CaM_N脱离peEF-2K型_TR公司.

图5.Ca的影响^二+/毫克^二+凸轮内凸轮上的比率?peEF-2K型_TR公司溶液复杂。
(顶)化学位移扰动peEF-2K型_TR公司Ca存在下IM标记CaM的研究^二+（以及缺乏镁^二+).完全加宽的共振用灰色条表示。观察到CaM的最大扰动_C.扰动模式与eEF-2K的存在所引起的扰动模式相似_TR公司（未磷酸化T348）(41)提出了eEF-2K的CaM识别模式_TR公司和peEF-2K型_TR公司在这两种情况下是相似的。(中间)Mg引起的扰动^二+（450毫米氯化镁₂)在IM上标记为CaM in the CaM?peEF-2K型_TR公司复合物（含300μM CaCl₂).凸轮上有明显的扰动_N;凸轮的扰动最小_C（除了大都会¹⁰⁹扩大到噪声以下的共振）。(底部)IM标记的凸轮中的扰动比较凸轮?peEF-2K型_TR公司含有300μM CaCl的缓冲液中的络合物₂以及450毫米MgCl₂，在310 mM MgCl存在下单独使用凸轮₂.数据表明，在高浓度下，Mg^二+取代Ca^二+在凸轮上_N导致它脱离peEF-2K型_TR公司.

如前所述，凸轮_C金属结合位点似乎也被钙所占据^二+在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复杂的，对比我们之前对CaM?CTM pep的研究(36)和凸轮?eEF-2K_TR公司(41)配合物，都是在没有镁的情况下进行的^二+分别使用高分辨率和低分辨率核磁共振方法。给出了类似的开放式凸轮结构_C在与peEF-2K型_TR公司而CTM-pep，很明显其Ca的轻微重排^二+-绑定EF手足以容纳Ca^二+.凸轮啮合的差别_C通过CTM（大约半个螺旋圈的位移）可以看到两个病例的比较；相应的EF手的微小变化似乎足以适应Ca^二+(图6).

图6.凸轮的比较_C/中的CTM模块peEF-2K型_TR公司以及CTM-pep复合物。
(A)凸轮_C/CaM与CTM-pep配合物NMR系综中的CTM模块（PDB:5J8H）(36)或者在摄像机里peEF-2K型_TR公司比较复杂。凸轮_C（CTM）在核磁共振和晶体结构中分别显示为红色（洋红色）和深蓝色（浅蓝色）。CTM在凸轮内大约半个螺旋圈移位_C在晶体结构上和核磁共振系综中比较。W85和I89侧链仅显示了核磁共振系综的五个代表性结构，以便于可视化。W85侧链在晶体结构和核磁共振系综中的平均空间位置相似。在这两种情况下，I89和A92（隐藏）侧链的方向有显著差异。(B)Ca的主干痕迹^二+-凸轮EF手（EF3和EF4）绑定_C在CaM?CTM-pep复合物的NMR系综（红色）中，说明了它们从CaM晶体结构中看到的空间位置的位移peEF-2K型_TR公司复杂（蓝色）。这些位移使凸轮_CEF手不适合协调Ca^二+（显示为凸轮的灰色球体?peEF-2K型_TR公司复合物）在CaM?CTM pep复合物中。

研究表明，eEF-2K对肽底物的最大活性与Ca无关^二+有相似的k_猫不存在时获得的值（11 s^?1)或存在（25秒^?1)相比之下，表观Ca增加了约900倍^二+-诱导CaM亲和力（37μM vs 42 nM）(42).相似的k_猫值表明二价阳离子（Mg^二+或Ca^二+)在CaM内对活性复合体的性质影响最小。相反，我们预测这些离子的主要作用是调节CaM/eEF-2K的整体亲和力_TR公司相互作用，也就是说，通过额外的相互作用来改变复合体的“浓度”，这些相互作用很大程度上独立于定义活性状态的那些相互作用。

凸轮的C端凸角与peEF-2K型_TR公司活动站点

连接eEF-2K的回路[调节元件（RE）]_TR公司CTM和KD包含⁹⁶PDPWA公司¹⁰⁰序列，在脊椎动物中完全保守(⁹⁷DPW公司⁹⁹被认为是活动所必需的(43).在摄像头中?peEF-2K型_TR公司复合物D97通过侧翼的P96和P98排列，分别通过侧链和主链与W99和A100的主链形成氢键。这种构象在RE内产生一个凸起，将W99放在由P98、F102、F138、R148、V168和Y231的侧链形成的口袋中(图7A).此配置将对齐“激活脊椎”[调用Kornev等等。(44)]组成凸轮_C以及CTM、RE和KD的高度保守的疏水性（R148除外）残基_N通过结合ATP支持CaM与活性位点的能量耦合(图7B).

图7.激活eEF-2K_TR公司通过摄像头。
(A)RE与KD的关键交互作用_N.(B)连接CaM的激活脊椎的残留物_C（暗黄色）至eEF-2K_TR公司说明了活动站点。eEF-2K型_TR公司残留物根据其AL2CO保存分数（青色，可变；栗色，完全保守）来着色。相应标签的颜色表示残基所属的域。RE的残留物用黑色字体标记，以避免与AL2CO着色方案混淆。催化位点残留物的标签采用斜体字。结构中缺少的AMP-PNP已在中建模。(C)对野生型全长eEF-2K（WT，black）及其相应的W85A（蓝色）和W99A（红色）突变体进行了荧光动力学分析。实验数据用填充圆表示，直线表示拟合公式2.误差线表示SDs结束n=2（重量）和n=3（突变）测量。插图显示了两个突变体的活性图谱的扩展。

考虑到凸轮中脊椎的紧密排列特性?peEF-2K型_TR公司复杂的是，人们可以预测它的破坏将产生深远的功能性后果。例如，一个W99A突变预计会比类似大小的Leu替换更令人不安，正如功能研究所证实的那样(45).此外，P98羟基化(43)或者是他的¹⁰⁷Lys突变(24)这两种情况都会使脊柱严重错位，对功能有害。这种影响与破坏性较小的His的影响相对较小¹⁰⁷丙氨酸突变(24).此外，序列分析表明，突变最少，但仍显着保守，脊柱残基，F138和R148，与附近的催化残基R144共价。这些是P139/P149/V145英寸美国黑熊和V137/V147/K143英寸牦牛可能导致无功能酶。因此，在我们提出的模型中，W85提供了本征结合能(46)与CaM的交互_C(36)，一部分用来稳定脊柱的结构和相应的激酶的活性状态；W99只起到了后者的作用。为了验证这一预测，我们使用了我们先前开发的荧光肽底物（Sox tide）(47)研究CaM浓度对野生型全长eEF-2K及其相应的W85A和W99A脊柱突变体活性的影响(图7C).如预期，W85A突变导致催化活性降低约9倍（野生型，0.63±0.02 s^?1;W85A，0.07±0.002秒^?1)CaM亲和力下降8倍（野生型，44±5nm；W85A，353±29nm）。相比之下，W99A突变导致催化活性降低约32倍(k_{obs，最大值}=0.02±0.001秒^?1)不影响CaM亲和力（38±10 nM）。

我们的凸轮结构peEF-2K型_TR公司complex提供了一个从原子细节上解释大量生物化学和功能数据的框架，这些数据是由对eEF-2K这一独特酶的近40年研究所产生的。这种结构，结合目前和以前的生化/生物物理测量，表明CaM的核心作用_C激活eEF-2K并定义激活状态的性质。相反，CaM_N似乎起到了更重要的支持作用，主要是作为Ca动态变化的传感器^二+例如，在神经元Ca^二+峰值/波，面对相对恒定的Mg^二+水平，提高活性复合物的细胞浓度。类似的Ca^二+-通过对CaM与ryanodine受体（RyR1亚型）复合物中CaM的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的研究，提示了诱导功能状态间的转移(48).类似于ryanodine受体（RyR2亚型）CaM复合物在其高钙和低钙中的结构^二+州(49)，这可能是通过改变eEF-2K与CaM的相互作用来实现的_N（也许还有凯姆_C)通过Ca^二+叶状体的结合和从Mg到开放状态的转变^二+-绑定关闭状态。总的来说，这种调节机制确保在正常细胞条件下通过eEF-2磷酸化维持活性物质的基础水平和最佳延伸率，同时允许其对特定信号进行快速调节。如前所述，pH对eEF-2K活性的影响可能是这张图片中的另一个问题(24).有人认为pH值的改变可以模拟Ca^二+-CaM的驱动构象变化(50)为调控CaM/eEF-2K相互作用中金属离子的需求提供了另一种机制。

另一个关于eEF-2K调节的问题，目前的结构尚未解决，涉及S500的刺激性自动磷酸化的机制(51)，也是蛋白激酶a（PKA）的靶点(52).S500埋在一个浅的口袋里，由H260、E264、H268和F309的侧链排列在与关键催化元件相对的表面上，与底座D274相距20?以上(图8).原则上，顺式磷酸化可以通过α1′的部分展开来实现，同时全长eEF-2K中完整的R环提供了额外的灵活性。S500上的自动磷酸化反应非常缓慢，需要在T348上预先磷酸化(42);我们不能检测到S500的磷酸化peEF-2K型_TR公司尽管与Ca孵育^二+还有镁^二+/ATP超过1小时。或者，反式（或PKA磷酸化）中的自磷酸化需要较少实质性的结构转变，并且发生在一个短暂组装的2:2物种中，其组成部分CaM呈反平行排列peEF-2K型_TR公司亚单位。这样的组装将与我们先前的交联质谱结果兼容(26)，与当前的异二聚体结构（图S6）不一致，没有引起明显的构象变化。CaM?eEF-2K的天然质谱研究_TR公司复合物显示了与2:2复合物相对应的电荷状态，尽管处于极低水平(26).关于使（或跟随）其它调节性磷酸化事件的构象变化的类似问题，例如在S366上[p90的靶点]^RSK公司(53)]由于这些调节性R环位点在eEF-2K中缺失，因此也一直没有得到解决_TR公司.

图8.S500在凸轮中的结合部位?peEF-2K型_TR公司复杂。
S500是激活自磷酸化的第二位点，埋在KD内的一个口袋里_C，通过涉及锌侧链的氢键稳定^二+-配位H260和E264，在距催化位点相当远的位置（例如，S500，Oγ–D274，Oδ1和S500，Oγ–K170，Nζ距离分别为20.0和29.7?），这表明顺式结构中此位置的自磷酸化需要显著的构象重排，包括α1′的部分去折叠。位置p图中还显示了在PBP处绑定的T348，以供参考。

材料和方法

凸轮结晶peEF-2K型_TR公司复杂的

eEF-2K的表达和纯化方法_TR公司和CaM，前者在T348处选择性磷酸化（产生peEF-2K型_TR公司)以及随后的1:1异二聚体CaM的纯化peEF-2K型_TR公司如前所述执行复合物(26,35).结晶试验中使用的最终样品包括~11.0 mg/ml的CaM?peEF-2K型_TR公司在含有20 mM tris（pH 7.5）、100 mM NaCl、3.0 mM CaCl的缓冲液中的络合物₂，1.0 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP；GoldBio），1.5 mM氯化镁₂，以及1.0毫米AMP-PNP（毫孔西格玛）。在豪普特曼-伍德沃德医学研究所的国家结晶中心，在油下进行了识别结晶条件的初步筛选。在内部进一步优化了潜在条件，确定了最佳条件如下：100 mM双三氯（pH 6.9），200至300 mM MgCl₂和20%至26%的PEG3350（聚乙二醇3350）以1:1或2:1的比例组合在Greiner 72孔微批量板（Hampton Research）上，在石蜡油（EMD化学品）下于室温下组合。不到12小时就出现了多个晶体团，几天内达到最大尺寸。然而，其中大多数都非常脆弱，衍射效果很差。单一条件，1:1比率，24%PEG3350和300 mM MgCl₂，得到了能产生高质量衍射数据的晶体。

结构测定

数据收集在布鲁克海文国家实验室的国家同步加速器光源II（NSLS-II）光源上，使用19-ID（NYX）光束线。利用autoPROC工具箱对同一晶体不同区域采集的两个数据集进行处理和组合(54)，得到一个分辨率为2.3？的数据集。水晶(P三₁21）有一个细长的单元(一=b=58.49︐，c=365.78?）包含一个凸轮?peEF-2K型_TR公司非对称单元中的异二聚体。用Phenix获得初始相。吕罗塞塔先生(55)以及从HHpred服务器获取的对齐文件(56)包含53个条目，包括与MHCK-Aα激酶结构域的晶体结构相对应的序列(28,29)，查克(30)，以及一些含有SEL-1和四萜重复序列（TPR）的蛋白质。初始模型是建立在多个周期组成的相器(57)，库特(58)和菲尼克斯。精炼(59).在初始构建结束时，使用PDB\u REDO服务器进一步优化(60)，得到一个含有469EEF-2K的模型_TR公司残基（88%）和凸轮的C-叶。凸轮N-叶的大部分（除了螺旋线α之间的环路_C和α_D)通过迭代手工拟合Coot，然后使用Phenix进行求精。用DALI服务器对凸轮N瓣褶皱与现有凸轮结构的比较(61)显示出与Mg非常相似^二+-绑定闭合形式。用Phaser和PDB:3UCW进行分子置换(38)以及凸轮的其余部分?eEF-2K_TR公司复杂的结构产生了一个几乎完整的模型。然后，使用Coot和phenix逐步添加和改进复合体结构中剩余的缺失部分。精炼和隔离(62).使用CheckMyBlob服务器识别阳离子(63)用Coot插入溶剂分子，用Phenix精制。最终的结构模型由493个和145个eEF-2K残基组成_TR公司分别为92.8%和97.9%，加1锌^二+，约2^二+，和5毫克^二+离子和145个水分子。AMP-PNP无明显密度。有关数据收集和优化的详细信息，请参见表1.

序列分析

利用ConSurf服务器获得eEF-2K的序列保守性(64).ConSurf通过同源序列的比对和系统发育分析，根据特定位置的进化速度来定义保护分数。非冗余UniRef90数据库中总共有150个序列(65)使用HMMER算法进行选择(E切断值0.0001）(66)，使用MAFFT-NS-i对齐(67)最大和最小序列同一性截断分别为95%和35%，并用于推导归一化守恒分数。保护得分分为9个格（级），变量最大的和最保守的分别占1和9。生成的对齐文件被读入UCSF ChimeraX(68)在eEF-2K上有代表_TR公司结构，相应的残基由它们的AL2CO分数着色(69).

溶液核磁共振波谱

¹³C组，¹H-Ile-δ1，Met-ε，²H，¹⁵N-标记凸轮（IM-标记凸轮）(41)而且没有标签peEF-2K型_TR公司(35)如前所述制备，并如上所述纯化相应的1:1异二聚体复合物。所有核磁共振样品（除非特别注明）在含有20 mM Hepes（pH 7.5）、100 mM NaCl、1.0 mM TCEP和5%的缓冲液（NMR缓冲液）中制备²H₂O、制备了以下样品：（i）在含有3.0mmCaCl的NMR缓冲液中，仅IM标记的CaM（~100μM）₂或（ii）作为相应凸轮的一部分?peEF-2K型_TR公司复杂（~147μM）；（iii）在含有5.0 mM EGTA和310 mM MgCl的NMR缓冲液中，IM标记的CaM（~100μM）₂;（iv）在含有3.0 mM CaCl的NMR缓冲液中，仅IM标记的CaM（~100μM）₂和300毫米氯化镁₂或（v）作为相应凸轮的一部分?peEF-2K型_TR公司复杂（~147μM）；（vi）在含有~150μM 2,2-二甲基-2-硅烷戊烷-5-磺酸盐（DSS）和0,0.2,0.4,5.0,20,103或310 mM MgCl的NMR缓冲液中的~50μM IM标记CaM样品₂（所有样品均含有EGTA，与Mg的比例约为1:60^二+);（vii）含有~18μM凸轮的样品?peEF-2K型_TR公司缓冲液中的复合物，包括20 mM Hepes（pH 7.5）、10 mM NaCl、0.5 mM TCEP、约150μM DSS和0.3 mM CaCl₂含0、1.0、3.0、6.0、12.0、36、68、115、240和450 mM MgCl₂.¹H，¹³C索菲亚特-HMQC(70)实验在所有样品上进行，扫描宽度分别为13.95 ppm（512个复合点）和12.0 ppm（128个复合点），在直接和间接维度上进行。所有实验均在25℃下在800 MHz Bruker Avance III HD光谱仪上进行，该光谱仪配备有一个三重共振低温探头，能够沿z轴心国。使用nmrPipe处理数据(71)并用nmrViewJ进行了分析(72).化学位移扰动（Δδ，单位：ppm）采用(41)

$? δ = \sqrt{{(δ_{裁判, H} ? δ_{H})}^{2} + {[\frac{1}{3.94} (δ_{裁判, C} ? δ_{C})]}^{2}}$

（一）

其中δ_参考，H和δ_{参考文献C}是参考¹H和¹³C-甲基化学位移和δ_H和δ_C是在相关配体存在下的相应位移。

小角x射线散射

在含有1.9 mg/ml（lc）和6.4 mg/ml（hc）的CaM?eEF-2K的两个样品上获得SAXS数据_TR公司复合物（未磷酸化的eEF-2K_TR公司)，如前所述(26).这些数据用ATSAS3.0.1软件重新分析(73)，结果与Will表3所示结果相同等等。(26)获得了。然而，从SAXS数据中获得从头算三维模型的方法略有不同。使用DAMMIF计算了hc和lc数据集的25个结构(74)在慢速模式下使用默认参数并使用DAMCLUST进行集群(75).对于hc数据集，共获得六个聚类，其中三个（hc_1、hc_2和hc_4）包含一个单一成员，每个包含两个（hc_5）或三个（hc_3）成员，最大的聚类[hc_6；所有其他聚类的归一化空间差异（NSD）=1.47±0.31]由17个成员组成。根据实验hc数据集（χ）对6_hc的平均包络进行了细化²=0.9766）使用DAMMIN(76)（使用默认参数以慢速模式运行）通过使用DAMSTART限制搜索量。对于lc数据集，两个集群包含一个成员（lc_1和lc_2），每个集群包含3个（lc_5）、5个（lc_6）、7个（lc_3）或8个成员（lc_4）。因此，根据实验lc数据集（χ²=0.7761和χ²=lc_3和lc_4分别为0.7767）。

根据凸轮的结构计算SAXS轮廓peEF-2K型_TR公司使用Crystol3的复合物(77)分别拟合lc和hc数据集，得到χ²值分别为1.504和3.217，表明前者提供了更好的符合预期的结构。利用SUPCOMB将从每个数据集（lc_3、lc_4和hc_6）计算的分子包络叠加在晶体结构上(78).凸轮的结构peEF-2K型_TR公司复合物拟合到lc_3簇合物的精细分子包络中，并对lc数据集的理论数据和计算数据进行了比较，如所示(图1C).

eEF-2K测量_TR公司镁存在下的活性^二+

eEF-2K的自磷酸化_TR公司（500 nM）在含有25 mM Hepes（pH 7.0）、2 mM二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA；40μg/ml）、50 mM KCl和5μM CaM的缓冲液中进行。反应在两种不同的条件下进行，一种是用15mmMgCl₂和0.15mm CaCl₂第二次使用150毫米MgCl₂和1.5毫米氯化钙₂.将反应混合物在30℃下孵育10分钟，并通过添加500μM[γ]来启动反应-³²P] ATP（100至1000 cpm/pmol），最终体积为250μl。eEF-2K的等分试样（10 pmol/20μl）_TR公司每隔0、10、23、32、40、60、120和300 s在5分钟内去除，并直接添加到热SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品装载缓冲液中，该缓冲液含有125 mM tris HCl（pH 6.75）、20%（v/v）甘油、10%（v/v）2-巯基乙醇、4%十二烷基硫酸钠和0.02%溴酚蓝，以终止反应。将混合物在95℃下进一步加热5分钟以确保完全变性。样品经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色。凝胶暴露在磷光成像暗盒中8小时，在台风9500成像仪中扫描，并使用ImageJ进行分析。通过干燥凝胶和切除eEF-2K来量化自磷酸化_TR公司–包含片段。放射性用Packard 1500液体闪烁分析仪测量。

全长eEF-2K和脊柱突变体的活性测定

在含有25 mM Hepes、50 mM KCl、10 mM MgCl的缓冲液中进行分析₂，150μM氯化钙₂BSA（20μg/ml）、100μM EGTA、2 mM DTT、0至4μM CaM和10μM Sox tide(47).化验使用浓度(C_E)未磷酸化野生型eEF-2K、W85A突变体或W99A突变体分别为5、10.5或8.5nm。反应开始于添加1mmATP。使用协同H4平板阅读器（BioTek）通过荧光（360 nm激发和482 nm发射）监测产品周转。把荧光数据转换成速率常数(k_{组织分解结构})，Devkota描述的协议等等。(79)被利用了。变化k_{组织分解结构}凸轮浓度(C_凸轮)适合于公式2求凸轮饱和时的最大速率(k_{obs，最大值})和凸轮亲和力(K_凸轮)价值观。实验分为两份（野生型）或三份（W85A和W99A突变体）。

$k_{组织分解结构} = k_{组织分解结构, 最大值} \frac{(C_{E} + C_{凸轮} + K_{凸轮}) ? \sqrt{{(C_{E} + C_{凸轮} + K_{C 一米})}^{2} ? 4 C_{凸轮} C_{E}}}{2 C_{E}}$

（二）

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