mRNA 疫苗工艺流程质控与功能性评价——实用案例解析

【字体: 时间:2022年07月18日 来源:安捷伦BioTek

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  Sohi 等人开发了一款针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗并使用小鼠和恒河猴对免疫反应进行评价。下面我们将对研究中疫苗的开发和功能验证做详细解读。

mRNA 疫苗及其优势

迄今为止,开发的针对 SARS-CoV-2 的疫苗中,基于 mRNA 的疫苗在安全性和有效性方面都显示出更有希望的结果。

mRNA 疫苗具有两个显著特点:

使用假尿苷修饰的编码抗原蛋白的 mRNA 和基于微流控产生的脂质纳米颗粒(LNPs)作为载体进行包封和递送;

mRNA 导入人体后翻译形成相应的抗原蛋白,进一步诱导机体进行特异性免疫应答,起到预防性免疫的作用。

作为第三代疫苗,mRNA 疫苗具有很多优势。

首先是研发周期短,能够针对病原体变异快速反应开发新型候选疫苗,这是因为编码不同抗原的 mRNA 化学结构类似,因此设计和开发新的 mRNA 疫苗也具有类似的步骤,通过搭建 mRNA 平台,mRNA 可以在几天内根据所需基因序列高通量体外转录快速产生,生产工艺简单可重复性强,易于进行规模化扩大;

其次,mRNA 的免疫原性强,具有双重机制可以同时引起体液免疫和细胞免疫,因而不需要额外的佐剂,更易于批量生产。

正是由于 mRNA 疫苗的种种优势,加之对抗 SARS-CoV-2 的高保护效力,新冠疫情爆发以来,mRNA 疫苗迅速受到关注并短时间内成为产业新星。

mRNA 疫苗的工艺流程和质量控制(QC)

mRNA 疫苗的核心生产流程主要包括:mRNA 制备、LNP 递送结合以及规模化生产。其中 mRNA 制备包括序列设计、质粒扩增、体外转录(IVT)、序列修饰;LNP 递送主要为 LNP 包封。在整个工艺流程的多个环节中均涉及多项质控步骤,其中质粒、体外转录 mRNA 模板和 mRNA 原液的核酸浓度测定 & 纯度检测、残留宿主蛋白测定、内毒素检测等质控步骤都可以选择使用酶标仪来完成。

Sohi 等人开发了一款针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗并使用小鼠和恒河猴对免疫反应进行评价。下面我们将对研究中疫苗的开发和功能验证做详细解读。

在体外转录(IVT)阶段,作者使用了“Epoch 2 紫外可见分光光度计搭配 Take3 微量检测板”对转录完成并纯化后的 mRNA 进行 A260/A280 浓度及纯度检测。

Agilent BioTek 的 Take3 和 Take3 Trio 系列微量检测微量检测板,与传统微量检测仪相比,检测速度更快、通量更高,可在 Agilent BioTek 全波长吸收光微孔板检测仪上进行 16 或 48 个样品检测,简洁友好的软件操作界面可同时检测多板样品,并使样品ID在多板之间连续分布排序,批量导出统计分析结果使结果输出更为方便,同时还具有维护简单易于清洁的特点。

IVT 阶段 QC 部分主要围绕宿主基因组 DNA 残留、蛋白残留和内毒素检测,作者使用荧光法搭配 PicoGreen® dsDNA 定量试剂盒进行 DNA 残留检测,浓度为 <0.01 μg/mL,使用吸收光法搭配 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白残留检测,浓度为 <5.0 μg/mL,均在可接受范围。作者测得纯化后 mRNA 内毒素含量为 <0.4 EU/mL,以及 LNP 形成后、贮存前后分别进行复测,LAL试剂测得内毒素含量均无显著变化。

 
 
图 1 Agilent BioTek Take3 和 Take3 Trio 微量检测板可搭配 Epoch 系列全波长微孔板分光光度计和 Synergy 系列多功能酶标仪,快速实现高通量 16 和 48 个微量核酸(DNA, dsRNA, ssRNA)检测,批量导出浓度和 A260/A280 等统计分析结果。相关链接——如何使用 BioTek 酶标仪,实现高通量微量样本吸收光检测?

包封率(Encapsulation Efficiency)测定

众所周知,RNA 的单链结构在暴露的情况下会快速水解,进入到体内还会被免疫细胞分解或引起过于强烈的先天免疫反应产生 IFNγ 从而阻碍 mRNA 在细胞内的翻译,此外,mRNA 本身带有负电荷,分子量又相对较大,很难穿过磷脂双分子层进入到胞内表达抗原蛋白,因此暴露的mRNA不能直接接种作为疫苗实现免疫预防的目的,需要对 mRNA 疫苗序列做修饰和包封。

使用尿苷酸类似物修饰的 mRNA 能够模拟细胞内的 mRNA 从而阻止免疫识别;而对 mRNA 进行包封,能够保证 mRNA 的稳定性和传输的可靠性。脂质纳米颗粒(LNPs)具有良好的生物相容性、长期稳定性和高负载能力等特点,是目前使用较多的 mRNA 包封和递送材料。LNPs 能够递送 mRNA 进入细胞的同时降低先天免疫效果,防止产生严重的炎症反应。

包封率(EE)是对 mRNA-LNPs 进行 QC 的关键指标,表示包裹在 LNP 内部的 mRNA 占全部 mRNA 的比例,通常要求包封率不低于 80%。

通过确定包封率还可以确定疫苗接种给药剂量。

文中对包封率的检测采用核酸探针 RiboGreen™ RNA 荧光法。作者使用 Agilent BioTek 的 Cytation 3 全功能微孔板检测细胞成像分析系统,激发光 485nm,发射光 528nm 分别检测破乳前(未包封游离 mRNA)后(总 mRNA)样品和标准品孔的荧光强度,以 mRNA 浓度和荧光强度进行线性拟合,计算包封率(EE%)=(总 mRNA 量-游离 mRNA 量)/总 mRNA 量 × 100,得出的包封率为 95%。

此外,文中还使用此荧光法进行 mRNA-LNPs 稳定性和可贮存性评价,作者对低温(5 ± 3℃)贮存 30 天的 mRNA-LNPs 置于室温 0、1、2、4、24 和 48 小时后进行检测,TE/TE+Triton X100 荧光强度显示相比于新鲜 mRNA-LNPs ,低温贮存的样本均无 mRNA 渗漏,表明作者开发的 mRNA-LNPs 具有稳定性好、耐贮存的特性。


图 2 以 RNA 浓度和荧光强度进行的标准曲线拟合,测定 LNP 包封率(EE)


图 3 TE/TE+Triton X100 荧光强度评估 mRNA-LNPs 稳定性和可贮存性

Gen5 软件进行包封率测定:双标曲拟合 & 自动结果导出

在进行加样时,可以选用试剂盒自带的标准品,同样也可以使用 mRNA 样品作为标准品开展实验。Agilent BioTek 超微量 Take3 检测板还可对 IVT 后纯化并修饰的 mRNA 样品进行浓度测定,梯度稀释样品 mRNA 可作为标准品,拟合标曲并用于包封率的测定。

标曲 1(破乳前游离 mRNA 浓度):因为RiboGreen 探针能够微量进入 LNP 内部,所以需要使用滤膜过滤去除游离 mRNA 获得 mRNA-LNPs,再加入 RiboGreen 探针后测得荧光值即为探针渗入 LNP 内结合 mRNA 的荧光值作为背景荧光值,在计算溶液中游离未包封 mRNA 浓度数据处理时扣除,以获得精确的浓度值;

标曲 2(破乳后总 mRNA 浓度):由于需要使用 Triton X-100 进行破乳,以释放 LNP 内部的 mRNA,测出样品溶液中所含有的总 mRNA 的量,而化合物 Triton X-100 的存在会使溶液中 mRNA  结合探针的荧光强度整体下降 8% 左右,但不会影响标曲线性,因此破乳后样品中 mRNA 检测时需要使用含相同浓度 Triton X-100 的 mRNA 标准品制作标曲,以获得精确的 mRNA 浓度。

数据处理:将测得的游离 mRNA 浓度和总 mRNA 浓度分别作为数据集,通过公式编辑器将包封率计算公式内置入检测方案模板进行计算可轻松获得包封率结果。将检测方案保存在软件数据库中可快速调取并开展多板检测。

 
图 4 Gen5 软件能够轻松对破乳前后样品进行双标曲拟合并计算 mRNA 浓度

 
图 5 数据处理将包封率计算公式内置到实验方案中,软件可直接导出包封率数据结果

 
 
图 6 Agilent BioTek的Synergy 系列多功能酶标仪,可实现 200 ~ 999 nm 全波长吸收光检测,荧光和化学发光检测。Hybrid 专利技术具有基于四代带宽可调光栅(Synergy H1 为 9 ~ 50 nm,Synergy NEO2 为 3 ~ 50 nm 带宽可调,能够更好地兼顾荧光探针的特异性和灵敏度)的全波长荧光检测和基于滤光片的均相时间分辨荧光(HTRF)、荧光偏振(FP)等高级荧光检测。使用 Synergy 系列多功能酶标仪,即可实现搭配 Take3 微量核酸浓度和纯度检测、基于吸收光的 BCA 蛋白残留测定、基于荧光搭配 PicoGreen 开展宿主基因组 DNA 残留测定、基于荧光搭配 RiboGreen 开展包封率测定、基于吸收光 LAL 和荧光 FrC 的内毒素检测,以及基于均相时间分辨荧光(HTRF)的 dsRNA 残留检测等。相关链接——空前但不绝“鲎”——重组C因子(rFc)新一代内毒素检测方法

mRNA 疫苗的功能性评价

体外转染效率和表达(In Vitro Transfection Efficiency and Expression)

作者使用编码 GFP 的 mRNA-LNPs 用于评价转染效率。在细胞融合度约 70% 时,将编码 GFP 的 mRNA-LNPs 分别加入到 HEK 293T 细胞(细胞株)、脐带血来源的间充质干细胞(人源原代细胞)培养体系中进行处理,使用活细胞成像方法进行 24 ~ 48 小时动态观测,结果显示,约 90 ~ 100% 的细胞表达 GFP 荧光蛋白,表明作者开发的 mRNA-LNPs 能够克服所有可能的屏障将包封的 mRNA 递送进入细胞。

为进一步评估转染效率,使用编码 S 蛋白的 mRNA-LNPs 处理 KG-1 细胞(人源树突细胞),24 小时后免疫荧光染色进行流式细胞分析,以评价 mRNA 编码的 S 蛋白在抗原呈递细胞的表达及细胞表面的定位,结果表明 0.5 μg 和 1 μg/cm2 编码 S 蛋白的 mRNA-LNPs 处理,有 66.1% 和 71.6% 的 KG-1 细胞表现出细胞膜表面 S 蛋白定位。


图 7 体外转染效率和表达评价。a,编码 GFP 的 mRNA-LNPs 在 KG-1、UCB- 间充质干细胞和 HEK 293T 三种细胞中的转染效率研究;b 和 c,使用包含 0.5 和 1 μg/cm2 mRNA 的 LNPs 处理,确定 KG-1 细胞表面 S 蛋白定位情况。

mRNA-LNPs 体外毒性评价

细胞铺板 24 小时后,使用 0.25、0.5、1 和 2 μg 的包含编码 S 蛋白的 mRNA-LNPs 处理 KG-1 和 HEK 293T 细胞,分别在 24 小时和 72 小时使用 XTT 测定细胞毒性。24 小时持续处理,细胞活力无显著变化;当 ≥0.5 μg mRNA 处理 72 小时后,KG-1 细胞活力显著降低,同样 ≥1.0 μg mRNA 处理 HEK 293T 细胞 72 小时后活力也显著下降。但是,即便是使用包含最高浓度 2 μg mRNA 的 LNPs 连续处理细胞,KG-1 和 HEK 293T 细胞的活力仍保持在 54% 和 76% 以上。对于 mRNA-LNPs 的体外毒性评价,也可采用 MTT 法进行检测。

疫苗免疫原性研究

作者对 mRNA-LNPs 注射小鼠和恒河猴的体液免疫反应进行评价,使用 Agilent BioTek 的 Epoch2 全波长吸收光酶标仪基于 ELISA 的方法测定第一次接种 56 天后血清内的 S 蛋白受体结合区(RBD)IgG 抗体。

结果显示:和对照组相比,接受 mRNA 注射 21、28 和 84 天后,小鼠血清中 S 蛋白 RBD IgG 抗体水平均显著升高;恒河猴第一次注射 28 和 56 天后 S 蛋白 RBD IgG 抗体水平和对照组相比也显著提高。加强免疫注射也获得了相同的结果。同样作者还使用 SARS-CoV-2 武汉株进行病毒中和试验(VNT),通过细胞病变效应 CPE 对中和效价进行评价;使用 ELISA 方法对细胞免疫反应 IFN-γ 和 IL-4 水平进行评价。


图 8 基于小鼠的疫苗免疫原性研究。(a)注射编码 S 蛋白的 mRNA-Lipofectamine 混合物后血清采集时间表。ELISA 结果显示 Balb/c 小鼠接受含有 10 或 20 μg mRNA 和脂质体的 mRNA - lipofectamine 混合物对照组在注射后第 21 (b)、28 (c)、84 (d) 天血清中抗 S 蛋白 RBD 中和抗体水平的比较。(e) Balb/c 和 C57BL/6 小鼠 mRNA-LNP 注射和血清采集时间表。ELISA 结果显示 Balb/c 和 C57BL/6 小鼠分别接受含有 1 或 10 μg mRNA 的 mRNA- LNPs 和对照组第一次免疫后第 14 天 (f) 和第 35 天 (g) 血清中抗 S 蛋白 RBD 中和抗体水平的比较。(h) 病毒中和试验(VNT)显示接受包含 10 μg 的编码 S 蛋白 mRNA 的 mRNA- LNPs 接种的 Balb/c 和 C57BL/6 小鼠血清与对照组以及 2 个血清阳性样本的病毒中和滴度倒数进行比较。(i) ELISA 法检测脾细胞接受 SARS-CoV-2 RBD 刺激分泌 IFN-γ 和 IL-4 。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。


图 9 基于恒河猕猴的疫苗免疫原性研究。(a) mRNA-LNP 注射恒河猴并采集血清时间表。ELISA 检测结果比较了在接受第一针 mRNA-LNP 疫苗的恒河猴和对照组在 28 天 (b) 和 56 天 (c) 后血清中抗 S 蛋白 RBD 的中和抗体水平。(d) ELISA 法测定恒河猴血清的终点效价倒数。* p < 0.05, **** p < 0.0001。

 
图 10 Cytation 系列高通量活细胞成像分析微孔板检测系统采用模块设计,不仅具有如 Synergy 系列的全功能吸收光、荧光和化学发光检测功能,而且还具有高通量自动化活细胞成像和高内涵分析功能,优异的环境控制不但能够进行不同滴度、浓度梯度和时间梯度活细胞成像转染效率分析,而且还可实现高通量 CPE 拍摄分析、基于报告基因病毒和假病毒的中和抗体评价等多种实验对疫苗进行功能性评价。


图 11 Cytation系列彩色明场高通量拍摄96孔板CPE。无病毒细胞对照孔(左),病毒处理孔显示细胞病变效应产生(右)。

总结

Sohi 等人开发并评价了 mRNA-LNP 疫苗的纳米颗粒特性、包封率、转染效率、体外毒性以及疫苗的稳定性和贮存性。最后,作者分别使用不同剂量的编码 S 蛋白的 mRNA-LNPs 注射小鼠和恒河猴评价免疫效率,基于 ELISA 检测中和抗体结果显示中和抗体水平显著升高,同样使用 ELISA 也能够检测到基于 TH1 细胞的免疫反应标志物病毒特异性 IFN-γ 的分泌。

Agilent BioTek 的 Epoch2 微孔板分光光度计在基于 A260 的体外转录纯化后的 mRNA 浓度和纯度评价、基于 ELISA 的体液免疫和细胞免疫反应评价等环节;Cytation3 全自动活细胞成像微孔板检测系统在包封率的测定方面为作者在 mRNA 疫苗的评价提供了非常大的帮助。

参考文献和资料

1、新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)

2、药典-微囊、微球与脂质体制剂指导原则

3、USP: Analytical procedures for mRNA Vaccine Quality EA966W_mRNA_Vaccine_Chapter_2022_02_1

4、Development of an mRNA-LNP Vaccine against SARS-CoV-2: Evaluation of Immune Response in Mouse and Rhesus Macaque. Vaccines (Basel). 2021 Sep 10;9(9):1007. doi: 10.3390/vaccines9091007.

5、Improved translation efficiency of therapeutic mRNA. Gene. 2019 Jul 30;707:231-238. doi: 10.1016/j.gene.2019.05.008. Epub 2019 May 4.

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