研究分享 | 肿瘤克隆结构：多的是你不知道的事

这项研究全程使用Mission Bio的 Tapestri高通量单细胞多组学平台，对急性髓系白血病(AML)患者的克隆结构和突变历史进行深度解析。

克隆进化（clonal evolution）模型认为，肿瘤起源于正常细胞，这些细胞突变并产生了异常的后代，而后代细胞又发生突变，形成大量的变异癌细胞。肿瘤的克隆多样性是由达尔文选择理论驱动的癌细胞不断进化、适者生存的结果。克隆多样性构成了肿瘤的异质性，使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一。因此，克隆结构的精确表征对于理解肿瘤的进化历史及其与治疗耐药性的关联是十分重要的。

肿瘤的线性进化（上）和分支进化（下）示意图

今天的文章将给大家介绍MD Anderson肿瘤中心的学者于2020年发表在Nature Communication上的一项研究。该研究全程使用Mission Bio的 Tapestri高通量单细胞多组学平台，对急性髓系白血病(AML)患者的克隆结构和突变历史进行深度解析。 

由于急性髓系白血病(AML)克隆多样性与治疗耐药、复发和不良预后有关。作者前期的批量测序（bulk-seq）数据推断克隆异质性和肿瘤系统发育的能力有限，因此想利用高通量的单细胞DNA测序（sc-DNA seq）阐明AML的异质性和揭示肿瘤的进化轨迹。Mission Bio Tapestri单细胞DNA+Protein多组学技术在此项研究中提供的高质量的单细胞数据，解决了bulk NGS面临的诸多挑战：

▪ Bulk NGS获得的克隆结构仅限于推理
▪ scDNA 数据能准确获得肿瘤的克隆结构和进化信息，区分肿瘤与非肿瘤细胞

▪ Bulk NGS 数据的平均化数据，掩盖了临床相关的重要信息
▪ scDNA能够获得变异合子性(Zygosity)、共突变（Co-Occurrence）和罕见克隆（Rare cells）等临床相关重要信息

▪ 肿瘤的异质性仅由单一层面定义
▪ Mission Bio的单细胞多组学技术从基因型+表型的多维度对疾病的异质性进行定义

研究中分析了来自123例AML患者的154份骨髓单核细胞(BMMCs)样本和外周血单核细胞（PBMCs）样本，其中64个样本采用Mission Bio 设计的覆盖19个AML热点突变基因的50扩增子panel（现已升级为20gene，127扩增子panel，点击查看详细信息），90个样本采用的是自主设计定制的37基因panel。检测的细胞总数达735,483个，每个样本检测细胞中位数为6,102，这是迄今为止最大的AML单细胞队列研究。

1 高灵敏度检测罕见克隆：

靶向的scDNA-seq数据显示这些病人中一共有31个AML相关基因发生突变，包含543种体细胞变异类型，分别是388个(71%)SNV和155个(29%) InDels。由于scDNA seq检测到的一些变异未能被bulk seq检出，为了保证scDNA seq的准确性和灵敏度，作者用ddPCR的方法对这些突变进行了验证。下图展示其中一个验证结果：在AML-34-001病人的NRAS基因2号外显子区的c.G35A点突变未能被bulk NGS检出，但是scDNA seq检测到了4359个细胞中有6个细胞（~0.1%)带有该SNV，这一结果也得到了ddPCR验证。证明Tapestri平台有着非常好的克隆检出灵敏度和准确性。

ddPCR验证scDNA seq数据

2 高显著性揭示突变互斥：

由于scDNA-seq数据是单细胞分辨率的数据，能够更准确地揭示单个细胞或者克隆中是否有共突变或者突变互斥。下图展示了sc-DNA seq真实数据相较于bulk NGS基于推断的数据，能以更高的显著性揭示IDH1和IDH2这两个功能冗余的基因在细胞中突变的互斥性。

突变共现性分析，scDNA-seq（左),bulk seq(右）

3 123例患者的克隆结构分析：    

123例AML患者中68例呈现克隆线性进化，55例呈现分支进化，分支进化的患者中还分为分散型和收敛型，且分支型进化患者呈现更明显的突变多样性和克隆异质性。

123例AML的克隆进化分类

与线性进化的患者相比，出现分支进化的患者有更多的突变

部分患者的克隆结构示意图

4 PDX模型重建AML病人克隆：

为了探究白血病起始细胞（LICs）在免疫缺陷小鼠上重现AML的能力，作者选取三例具有高度分支克隆结构的AML样本，进行人源LICs的异种移植（PDX）。后续对PDX样本进行scDNA分析，发现与原始的AML样本相比，PDX克隆多样性降低但基本能反映LIC群体的异质性和功能性。这一结果提示可以利用LIC构建PDX模型，进行跨时间的肿瘤克隆进化研究，解决病人样本获取不易、数量较少的问题。

选取三例病人，移植其骨髓细胞到免疫缺陷小鼠上

病人自身与其PDX模型的克隆组成比较

5 基因型+表型多维度分析：

为了实现基因型+表型的同时分析，作者选取了26例患者进行单细胞DNA和表面蛋白的同时检测。如下图所示，作者使用Mission Bio自定义抗体标记试剂盒和寡核苷酸偶联的抗体，一共检测了15种细胞表面蛋白（点击查看Mission Bio 45种细胞表面蛋白panel）。

通过分析下面这例病人基因型，该病例有TP53的单、双和三突变逐步获取的情况，同时发现了两个表型异常的群体，CD34+、CD117+的成髓细胞群体（TP53单突变）和CD11b+、CD64+的单核细胞群体（TP53单突变），提示在恶性造血进展过程中伴随着突变的逐步获取。

6 治疗压力改变病人的克隆结构：

15例患者在诊断、治疗和复发时间点的纵向scDNA分析揭示治疗过程中的克隆进化。以下展示了三种不同的治疗反应：

（1）达到临床缓解，原先存在的克隆导致复发
 
❖ 诊断时的主要致病克隆为NMP1-FLT3ITD（粉色）
❖ azacitidine和sorafenib治疗，达到完全缓解（CR）
❖ 最终导致复发的NPM1-FLT3克隆（黄色）在最初在诊断时为1.7%，CR后急速扩张
❖ 克隆选择是导致复发的潜在机制

（2）达到临床缓解，新的克隆出现导致复发

❖ 诊断时的主要致病克隆为WT1p.A382fs-NPM1-NRAS的三突变克隆（粉色）
❖ azacitidine、sorafenib和cytarabine治疗，实现CR
❖ 复发期间扩增的WT1p.S381fs克隆(紫色)在诊断时未被检测到
❖ 治疗后新出现的克隆导致复发

（3）难治性AML病例的治疗反应
 
❖ 分支进化的难治性AML病例在治疗期间显示了高度适应性的克隆结构
❖ 两名患者都服用了FLT3抑制剂，FLT3突变的克隆略有减少，但没有实现CR
❖ 其他克隆的扩展和选择导致了治疗的耐药性

该研究利用单细胞多组学技术，对AML病人进行了基因+表型队列研究，揭示了细胞水平的突变共发生，并能够重建以克隆进化的线性和分支模式为特征的突变历史，后者包括趋同进化。通过异种移植，展示了平行进化的单个亚克隆的白血病起始能力。此外，通过同时进行单细胞DNA和细胞表面蛋白分析，阐明了AML的遗传和表型进化。最后，对纵向样本的单细胞分析揭示了治疗性耐药的潜在进化过程。总之，这些数据揭示了AML的克隆多样性和进化模式，并强调了它们在精准医疗时代的临床相关性。

原文：Morita, K., Wang, F., Jahn, K. et al. Clonal evolution of acute myeloid leukemia revealed by high-throughput single-cell genomics. Nat Commun 11, 5327 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-19119-8
                                                             
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Mission Bio正在不断进行Tapestri 平台产品升级。基因有限公司于2022年正式成为美国Mission Bio公司的合作伙伴，提供Tapestri系统的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。期待和更多领域先锋一道，攻克疾病研究难题，造福更多患者。如果您对单细胞多组学感兴趣，可以扫描左边二维码进行一对一沟通，或联系您身边的“基因人”。