如何为您的Western成像保驾护航?

【字体: 时间:2022年07月04日 来源:基因有限公司

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  以往我们介绍了很多关于电泳,关于抗体孵育相关的内容,今天我们来聊一聊WB的成像技术。

蛋白质免疫印迹
Western Blot

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。以往我们介绍了很多关于电泳,关于抗体孵育相关的内容,今天我们来聊一聊WB的成像技术。

不同的成像方法

目前的成像方法包括:比色法,化学发光法,荧光法。比色法和化学发光通过辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶促反应起作用。同时,荧光方法不依赖于反应,而是依赖于可以直接可视化的荧光团偶联抗体。使用最普遍的为化学发光法,其具有灵敏度高,操作简单,线性范围广等优势。


A:比色法    B:化学发光法    C: 荧光法

化学发光法:HRP在过氧化氢的存在下,氧化底物鲁米诺(lumino)并发光,通过发光增强剂可以使发光灵敏度提高千倍以上,用X射线胶片,CCD照相机成像装置或检测化学发光的成像仪捕获。

化学发光法高品质成像的必备条件

1  灵敏度

蛋白免疫印迹实验最常见的挑战就是检测低丰度目标蛋白。这需要优化蛋白免疫印迹流程的所有上游步骤,以及选择可能具有最高灵敏度的成像系统。

为了提高仪器的灵敏度,成像仪常采用像素合并技术,如下所示:

图示为2×2的像素合并,感光芯片的原始分辨率为16(4x4)像素。启用 2x2 的 Binning 模式,相当于将4个像素作为一个像素的模式读出,以这种模式拍摄可以将4个像素点所采集的信号叠加,相机灵敏度可以提升至原始输出的4倍,但是输出的图像分辨率却为原始分辨率的四分之一。同理,采用4x4的 Binning 模式,相机灵敏度可提升至原始输出的16倍,但图像分辨率降至原始分辨率的十六分之一,因此可以通过像素合并(Binning),增加像素尺寸,提高灵敏度。

2  分辨率

成像仪的分辨能力主要取决于样品距离、透镜质量和传感器分辨能力。要获得高分辨率的图像,就需要引入失真最小的高质量镜头。高分辨率和高灵敏度(低 f值)都需要高质量的镜头高像素传感器如果配置较差的镜头,也无法捕获良好的图像。
 
3  曝光时间和背景噪音

化学发光本身信号较弱,需要更长的曝光时间, 而在曝光时间超过5-10s时,CCD芯片就会发热,没有制冷设备的芯片,这种产热出现的“白的像素点”就会遮盖图像,图像到处可见雪花。

降低CCD的噪音就能提高CCD的监测能力,噪音在制冷CCD中基本可以被深度制冷的Peltier消除。化学发光本对CCD的降噪要求很高,应该选用深度制冷CCD相机和高通透镜头相结合,才能捕捉到微弱信号,减少背景噪音,提高成像清晰度。

4 动态范围

动态范围决定着你能否同时在一张胶上面同时看到强信号和弱信号,而且他们之间能够保持比较好的定量关系,一般动态范围采用数量级来表示,数量级越大表示动态范围越宽。简单来说,动态范围表示一个图像中最亮和最暗的比值,动态范围值越高,CCD性能越好。

5 光圈值

光圈用来控制透过镜头进入机身内感光面的光量,它的大小决定着通过镜头进入感光元件的光线的多少。光圈F值为焦距与镜头直径的比值,F值越小即镜头直径越大,光通量越大,灵敏度越高。


北京百晶生物技术有限公司

1  百晶生物化学发光成像分析系统有5款在售型号,有一体机与分体机可选。迷你小巧的机身,大大节省实验空间。高灵敏科研级制冷CCD,大光圈镜头,保证成像质量。可支持化学发光成像分析、凝胶成像分析、蛋白凝胶成像分析、多色荧光成像分析等,满足多种实验需求。

2  正在使用的客户:

北京医科大学;东北大学;华中农业大学;中山大学;西安交通大学;西北大学;兰州大学;武汉大学;首都医科大学等等客户

3  优秀的成像结果:

 

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