摘要
圆形精子细胞注射（ROSI）技术在一定比例的男性不育的临床治疗中具有很大的应用前景。然而，ROSI胚胎发育潜能的低下在很大程度上限制了其临床应用，其机制尚未完全阐明。在这里，我们描述了小鼠ROSI胚胎的转录组，染色质可及性，以及DNA甲基化的情况，这些胚胎来自于早期的圆形精子细胞，采用单细胞多组分测序方法。通过询问这些数据，我们确定了ROSI胚胎在原核阶段的重编程缺陷，这主要与一组小合子基因组激活基因的错误表达有关。我们筛选出一种小分子化合物A366，它能显著提高ROSI胚胎的发育潜能，其中A366可以通过改变表观遗传和转录状态来部分克服重编程缺陷。总体而言，我们的研究揭示了ROSI胚胎的重编程缺陷，以了解潜在的潜在的发展潜力，并提供了一个途径，以优化ROSI技术。
简介
无精子症是导致男性不育的主要因素，约占男性总人口的1%(1).在一些不育男性中，圆形精子细胞是睾丸活检中最成熟的单倍体细胞，而圆形精子细胞注射（ROSI）的发展可以帮助他们有自己的后代(2).尽管目前已有研究表明ROSI技术在临床上的应用，但限制该技术的一个主要瓶颈是重建胚胎的发育潜力受到损害(三);因此，有很大的需求来阐明这种表型在ROSI胚胎中的潜在机制。
在精子发生过程中，单倍体雄性生殖细胞经历了明显的成熟过程，包括组蛋白-精蛋白交换和染色质凝聚。受精后，发生广泛的表观遗传重编程，以确保将亲本遗传或表观遗传信息正确传递给合子(4–6).因此，雄配子表观基因组的正确重编程对于受精时正确的表观遗传重置至关重要(7)以及随后的早期胚胎发育。不同于传统的体外受精或卵胞浆内单精子注射（ICSI）方法，ROSI采用圆形精子细胞，一部分重建的胚胎可以发育到足月(8).以往的研究表明，在精子发生过程中，有几个阶段的圆形精子细胞(9,10)早期的圆形精子细胞被证明是次优的ROSI成功率(9).因此，患有严重精子发生缺陷的不育男性，如早期圆形精子细胞停滞，由于重建胚胎的发育潜能受损，很难通过ROSI技术进行治疗。
在描绘早期胚胎发育过程中的表观遗传重编程方面已经取得了突破，如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构的重编程(11–13).不同表观遗传修饰之间的相互联系及其与转录因子的协同作用指导着细胞命运的确定和早期胚胎的发育(14–17).以前的研究发现，在ROSI胚胎的雄性原核中存在异常的表观遗传修饰和异常的染色体分离(18–20)表明表观遗传重编程缺陷与发育潜能受损之间存在关联。然而，目前尚不清楚重编程缺陷如何改变ROSI胚胎的细胞行为。据推测，不完全的表观遗传修饰，如组蛋白修饰、DNA甲基化或染色质凝聚，可能会影响ROSI胚胎随后的胚胎重编程过程，从而导致发育潜能低下(18,19).在这方面，解剖植入前ROSI胚胎的表观遗传重编程路线图是优化目前ROSI方法的先决条件(21).
随着单细胞测序方法的出现，特别是基于单细胞多组分测序的方法(22,23)，现在可以在单细胞分辨率下同时破译控制不同分子层的复杂调控网络。在本研究中，我们应用单细胞多组分测序方法来探讨ROSI胚胎的分子特征。转录组、甲基组和染色质可及性的比较分析揭示了早期圆形精子细胞重建的ROSI胚胎的重编程缺陷，这些缺陷与一组小ZGA（合子基因组激活）基因的错误表达有关。用一种选择性常染色体组蛋白赖氨酸甲基转移酶2（Ehmt2，又称G9A）抑制剂A366处理ROSI胚胎，可在一定程度上改变一组小ZGA基因的表达，提高ROSI胚胎的发育潜能。
结果
着床前小鼠ROSI胚胎转录组、染色质可及性及DNA甲基化研究进展
本研究中使用的小鼠ROSI平台如前所述(24).在这里，我们使用早期圆形精子细胞的细胞核（图S1，A和B）进行胞浆内注射以获得ROSI胚胎。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析表明，本研究使用的圆形精子细胞为RS2期精子细胞，仍处于精子形成的早期阶段（图S1，C至E）(9).然后我们证实了ROSI和ICSI胚胎在受精时的发育过程基本上是同步的（图S2，A到C）。在C57BL/6N×DBA/2N背景下产生的ROSI胚胎的囊胚率（14.10%）和活产率（10.87%）与之前的研究结果相当（图S2，D到G）(9)但低于之前的两项研究(25,26).这种差异最有可能的解释是我们使用了更早的圆形精子细胞（图S1，C到E）。与ROSI相比，ICSI胚胎的囊胚率为51.61%，活产率为35.25%。ROSI和ICSI都经历了相似的微操作过程，只有单倍体雄性生殖细胞的发育阶段不同。在B6D2F1背景下构建胚胎时，也观察到类似的结果（表S1）。早期圆形精子细胞未成熟的表观遗传状态可能使其对受精后的表观遗传重编程更有抵抗力(9,19,27).所有活胎及其胎盘的重量在ROSI和ICSI胚胎之间是可比较的（图S2，H和I）。此外，通过ROSI或ICSI获得的成年小鼠的体重和生殖能力也无法区分（图S2、J和K），这表明ROSI胚胎潜在的发育缺陷在一个相对狭窄的发育时间窗口内，如果胚胎克服了这个问题，那么它们随后的发展就相对正常了。
多组分测序可以同时分析基因表达、DNA甲基化和染色质可及性。为探讨ROSI胚胎的表观遗传重编程信息，对ROSI胚胎的每个细胞进行单细胞多组分测序。本研究共收集138枚ROSI胚胎，以90枚ICSI胚胎为对照，消除胚胎微操作技术本身的影响，涵盖了植入前发育的6个关键阶段，以及包括精子、圆形精子细胞和中期II（MII）卵母细胞在内的配子(图1A).我们总共测序了452个RNA样本和493个DNA样本。经过严格的质量控制，428个细胞保留了RNA数据，439个细胞保留了DNA数据用于后续分析。每个细胞平均检测到9108个基因（图S3A）、16549572个GCH位点和1871398个WCG位点（详见材料和方法，图S3、B至F和表S2）。数据标准化是为了消除测序方法本身的变化。此外，当根据基因组覆盖率或测序深度将每个阶段的细胞分为三组时，我们发现单个细胞的基因组覆盖率或测序深度的差异对DNA甲基化或染色质可及性影响不大（图S4，A到D）。然后分别对每一层数据进行无监督聚类分析。t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）表明，同一发育阶段的细胞通过基因表达更紧密地聚集在一起(图1B以及图S5，A和B）。主成分分析（PCA）显示了ROSI胚胎DNA甲基化和染色质可及性的差异(图1，C和D，以及图S5、C和D）。从这两个数据集中获得了关于推断拷贝数变化（CNVs）的一致结果，并且胚胎的性别对这些结论没有影响（图S6，A到K，和S7，A到D）。我们还关注了与基因表达调控相关的表观遗传调控元件。在原核期（PN3和PN5）转录起始位点（tss）的DNA甲基化差异明显，发育到囊胚期时，tss的甲基化差异变得可比(图1、E和F).与ICSI对照组相比，ROSI胚胎PN3原核的DNA甲基化水平更高，这与以往的研究基本一致(18,19)ROSI胚胎PN5原核呈低甲基化(图1G).同时，在TSSs周围的染色质可及性方面，ROSI胚胎从原核期表现出较高的染色质可及性，在发育到4细胞期时变得可比(图1，H至J).这些结果表明，在ROSI胚胎着床前的发育过程中，DNA甲基化和染色质可及性的重编程在全球范围内都得到了实现，但与ICSI胚胎相比仍有一定的差异，尤其是在原核阶段。
ROSI胚胎母子转换相关基因的错表达
如上所述，受精后ROSI胚胎原核发生的表观遗传重编程似乎与ICSI对照组不同；特别是ROSI胚胎的雄性原核具有独特的表观遗传特征。与这一发现相一致，分别在PN3、PN5和2-细胞期检测到ROSI和ICSI胚胎中1145、332和981个下调的差异表达基因（DEGs）(图2A以及表S3）。值得注意的是，与ICSI对照组相比，ROSI胚胎在原核期（PN3和PN5）上调的基因主要集中在母体RNA中，而下调的基因则与微小的ZGA过程有关(图2B和图S8A）(28).小ZGA发生于小鼠单细胞胚胎的中晚期，对大ZGA的启动和早期胚胎发育至关重要(29).加权相关网络分析（WGCNA）结果进一步证实了次要ZGA基因的表达模式（图S8、B和C）。对ROSI胚胎PN3期和PN5期下调基因（264个）的基因本体分析表明，这些基因在“染色质组织”和“肌动蛋白细胞骨架组织”等过程中富集(图2C以及图S8、D和E）。用定量聚合酶链反应（qPCR）证实ZGA小基因的错表达。在16个候选基因中，有13个小的ZGA基因（例如。，卡扣2,Ehbp1型,雷14，和猫) (30)证实在PN3期ROSI胚胎中低表达，验证率为81.3%(图2D以及图S8F）。我们发现母体RNA的某些基因在ROSI胚胎的原核阶段也被错误表达（图S8，G和H）。值得注意的是，ROSI胚胎中下调的小ZGA基因在染色质和细胞骨架组织过程中富集，这表明小ZGA基因的错误表达可能与染色质/细胞骨架组织缺陷有关(31).使用错误发现率（FDR）分析可以很好地再现PN3阶段的这些结果（表S3）。
为了检测ROSI胚胎在原核期染色质/细胞骨架组织是否真的异常，对ICSI和ROSI胚胎的原核形态进行了分析。我们发现，ROSI胚胎雄性原核的平均直径明显小于ICSI对照组，并且这种表型维持到PN5期(图2，E和F).虽然在PN3期，ROSI胚胎的雌性原核没有明显的差异，但在PN5期，它比ICSI胚胎大(图2F).此外，组蛋白H3赖氨酸9二甲基化（H3K9me2）的异常沉积，这与染色质的一些特征，如叶片相关结构域密切相关(32)以及拓扑相关的域边界(33)在ROSI胚胎雄性原核4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）致密异染色质中观察到(图2，G至I)，与之前的研究一致(19).综上所述，我们的数据表明，ROSI胚胎具有母性到合子转换相关基因的错误表达，并且显示出染色质/细胞骨架组织缺陷。
ROSI胚胎染色质可及性的动态变化及其与ZGA基因误表达的关系
哺乳动物早期胚胎发育伴随着染色质的时空重构，提示其潜在的调控功能(11).基于阶段特异性染色质可及性景观，我们发现，在ROSI胚胎的雄性PN5原核中，微管解聚和蛋白质定位对微管细胞骨架相关术语的负调节作用显著，而核膜组织相关术语在PN3期富集（图S9A）。我们分析了ROSI和ICSI胚胎在原核期染色质可及性的差异。我们发现ROSI和ICSI特异性核小体缺失区（NDRs）在启动子区富集(图3A)与早期胚胎的基因表达密切相关(14) (图3B以及图S9，B至D）。低输入dna酶I-qPCR（liDNaseI-qPCR）用于验证测序结果。我们发现在ROSI和ICSI胚胎中有3个GCH甲基化水平低的基因座是封闭的，而在ROSI和ICSI胚胎中有两个GCH甲基化水平高的基因座是开放的。相比之下，5个ndr在ROSI胚胎中被证实是特异性关闭的，而6个ndr在ROSI胚胎中是特异性开放的。这些结果与测序结果基本一致(图3C以及图S10，A到N）。
然后我们集中研究了在ROSI胚胎中表达错误的小ZGA基因。在PN3期448个下调和98个上调的小ZGA基因中，分别有52个和11个基因改变了染色质的可及性(图3D和表S4）。值得注意的是，52个下调基因（例如。，Ankrd44)由于染色质不易获得，因此在生物过程中富集了“肌动蛋白细胞骨架组织”和“细胞器定位”等基因(图3，D至F).一致地，ROSI PN5胚胎中下调的小ZGA基因与纺锤体定位的建立有关（图S11A）。这些数据表明，ROSI胚胎原核染色质可及性异常可能与细胞骨架组织关键的小ZGA基因的错误表达有关。对NDR数据的进一步FDR分析也可以重现主要发现（表S4）。
转录因子通过与增强子结合发挥其功能，可能与ROSI胚胎染色质可及性的变化有关(14).我们使用超几何优化基序富集（HOMER）来识别ICSI胚胎远端ndr中转录因子的富集结合基序（图S11B）。与以前的报告一致(11,15)特异性蛋白1（SP1）的基序在原核期富集。SP1在原核期显示出相对富集的ROSI特异性远端NDRs而不是ICSI特异性的远端NDRs（图S11C）。
ROSI胚胎DNA甲基化重编程改变的研究
哺乳动物胚胎基因组经历了一个逐步的DNA去甲基化/再甲基化过程(34,35)并且ROSI胚胎始终处于异常的DNA甲基化状态(18,19).为了剖析ROSI胚胎DNA甲基化水平的重编程缺陷，我们分析了DNA甲基化的数据层。我们发现在本研究中使用的精子和圆形精子细胞都是高甲基化的，而MII卵母细胞是中度甲基化的（图S12A），这与以前的研究一致(36,37).受精后，ROSI和ICSI胚胎的雄性原核经历了一轮类似的大范围DNA去甲基化。到胚泡期，全球DNA甲基化水平变得相当（图S12A）。尽管整体去甲基化已基本实现，但受精后ICSI和ROSI胚胎全基因组中差异甲基化区域（DMRs）的比例显著增加，最显著的变化出现在原核阶段（PN3和PN5）(图4A)，这在图1C。这种差异一直持续到后来的阶段(图4A)提示ICSI和ROSI胚胎DNA甲基化重编程模式存在差异。ICSI或ROSI胚胎原核期的高DMR和低DMR均在启动子、内含子和外显子区域富集（图S12、B和C），表明DNA甲基化变化与基因表达之间可能存在相关性（图S12D）(17).同样地，10个dmr被证实在ROSI和ICSI胚胎之间存在差异甲基化，这是基于亚硫酸氢盐基因组PCR的Sanger测序(图4B以及图S12E）。
为了证实DNA甲基化改变是否也与母体到合子的转变有关，我们分析了在ROSI胚胎中下调的448个小ZGA基因的DNA甲基化水平。我们发现有65个基因在启动子区域甲基化。对这些高甲基化的小ZGA基因进行GO分析也可以丰富细胞骨架相关术语(图4，C至E和表S4）。使用FDR，也可以获得类似的结果（表S4）。值得注意的是，我们发现卡恩特1（也称为241017L17RIK公司),Aph1a型,Cdk16型,Lrrc8型d，Mllt4型,Rac3型,雷14,Sipa1l3型,塔夫5,Zfp703型，和系统7]与DNA甲基化和染色质可及性改变有关(图4，F和G).在这些基因中，Rac3型编码一个核受体辅活化因子，参与细胞骨架和细胞核的组织(38).
A366处理提高了ROSI胚胎的发育能力
根据单细胞多组分测序分析和实验数据，ROSI胚胎重编程缺陷主要发生在原核期，表现为转录组和表观遗传修饰的变化。为了支持这一点，圆精子细胞的某些表观遗传修饰（如H3K9me2）也可以在受精后传递到雄性原核(图2，G至I).因此，我们询问是否有先前未被确认的小化合物，可以通过靶向特定的表观遗传修饰来提高ROSI胚胎的发育潜力。为此，我们筛选了一个由178个小化合物组成的文库，这些化合物以表观遗传修饰为目标，包括DNA甲基化和组蛋白修饰。基于ROSI胚胎发育潜能，我们从三个方面评价了这些小化合物的最终效果：（i）对早期胚胎无毒，（ii）提高囊胚发育率，（iii）提高活产率(图5A).
我们的分析表明，重编程缺陷主要发生在2细胞期之前；因此，当ROSI胚胎进入早期2细胞期时，在注射圆形精子细胞后20小时对其进行小剂量复合处理(图5B).我们发现一系列H3K9me2甲基转移酶G9A（编码Ehmt2型)抑制剂均显示出提高A366等ROSI胚胎囊胚率的趋势(39)BIX01294和BRD4770(图5C).值得注意的是，A366在这些候选者中表现最好(P<0.01）(图5，C和D)，最佳治疗时间范围（注射后0至20小时）和剂量（300纳米）（图S13，A至C）。与这一发现相一致，在用于ROSI测定的圆形精子细胞和ROSI胚胎的雄性原核中可以观察到H3K9me2的沉积(图2，G至I，以及图S13D）。此外，Ehmt2型尽管不属于DEGs（图S13E），但在PN3期ROSI胚胎中也表现出较高的表达水平(P<0.05）(图5E).
确认H3K9me2异常沉积和过量沉积的结果Ehmt2型表达，我们分析了ROSI胚胎在敲除或过度表达后的发育能力Ehmt2型.击倒Ehmt2型使用小干扰RNA（siRNA）（图S13F）可显著提高ROSI胚胎的囊胚率（36.30%和35.30%）Ehmt2型siRNA与对照组的15.80%相比，P<0.001和P分别<0.01；图5，F和G，以及表S1）。相反，什么时候Ehmt2型过度表达时，H3K9me2沉积增加(图5，H到K和图S13，G和H），并且ROSI胚胎的囊胚率以剂量依赖的方式下降（图S13I）。然而，同时用A366治疗Ehmt2型过度表达组不能消除Ehmt2型过表达阻断对胚胎发育的影响(图5，L和M，以及表S1）。用A366处理ROSI胚胎可使活产率提高两倍左右（18.70%对9.30%；P<0.001）(图5，N和O，以及表S1）。值得注意的是，用A366处理过的ROSI胚胎的活后代是健康和可育的（图S13，J到L）。此外，用A366处理的活体受精卵的活产率与对照组相当，表明A366治疗的安全性（图S13M）。同时，A366处理可显著提高小鼠ROSI胚胎的囊胚率和全期发育。
A366处理可部分克服早期圆形精子细胞来源的ROSI胚胎的重编程缺陷
为了说明A366如何提高ROSI胚胎的发育潜能，对经A366处理的PN5期ROSI胚胎进行单细胞多组分测序，以未经处理的ROSI胚胎和ICSI胚胎为对照。以基因表达谱为基础，对聚类细胞进行降维分析。我们发现ROSI和ICSI胚胎可以分成两个独立的细胞团(图6A)说明这两种类型的胚胎在PN5期已经表现出一定的差异。值得注意的是，A366处理可以改变ROSI胚胎的整体基因表达模式(图6A).然后使用DNA甲基化和染色质可及性数据（近端NDR）进行无偏细胞聚类。与转录组数据一致，A366处理过的ROSI胚胎从雄性和雌性原核中都恢复到了独立的细胞状态(图6、B和C).这些数据与A366可能影响ROSI胚胎发育潜能的研究结果一致。
然后我们分析了ROSI、ROSI处理（A366处理）和ICSI胚胎之间的分子差异。为此，首先分别鉴定了基因表达、染色质可及性和DNA甲基化水平的差异。根据A366治疗后的模式，将其分为三类（表S5）：（i）完全修正，（ii）部分修正，和（iii）未修正。在ROSI胚胎332个下调基因和465个上调基因中，A366可分别修正每个基因组165个和159个基因的表达(图6D，图S14A和表S5）。值得注意的是，A366修饰的下调基因主要与肌动蛋白细胞骨架和染色质组织有关(图6D)与在ROSI胚胎原核期观察到的缺陷一致(图2，E和F).A366处理还可以改变ROSI胚胎雄性原核（1106例中的760个）和女性原核（1232个中的874个）中ICSI特异性近端ndr的大部分染色质可及性(图6E，图S14B和表S5）。值得注意的是，这些修改后的ICSI特异性ndr的邻近基因在雄性原核的微管解聚和胚胎形态发生过程中富集，在雌性原核中的星体微管组织中富集(图6E).在DNA甲基化方面，在A366处理的胚胎中，高甲基化的DMRs和ROSI胚胎中的低甲基化DMRs可以观察到类似的修正作用。值得注意的是，与细胞骨架组织相关的基因的DNA甲基化状态可以在雌性原核中得到修正（图S14，C和D）。在FDR分析的基础上获得了大体一致的结果（表S5）。为了确定A366处理的改性效果是否与H3K9me2修饰有关，我们分析了这些DMRs在H3K9me2峰上的分布。考虑到圆形精子细胞中存在稀疏的H3K9me2信号，利用先前报道的卵母细胞H3K9me2染色质免疫沉淀测序数据进行分析(40).值得注意的是，在雌性原核中，经A366修正的高甲基化dmr与H3K9me2峰的重叠比不能修正的dmr更明显（图S14E）。
如前所述，近端NDRs和DNA甲基化都与基因表达调控有关。因此，我们试图确定A366修饰的基因与启动子区域的染色质可及性或DNA甲基化变化有关。我们发现一组基因（165个上调基因中的46个和159个下调基因中的36个）的表达Myh9,努马1，和胶质3与染色质可及性有关，而不是启动子区域的DNA甲基化。相反，另一组基因（165个上调基因中的82个和159个下调基因中的31个）的基因表达，例如Arf5型和轴1与DNA甲基化有关。塔尔P3与染色质可及性和DNA甲基化有关(图6F).此外，A366处理能恢复ROSI胚胎雄性原核的形态(图6，G和H，以及图S14，F和G）。综上所述，A366处理可以改善ROSI胚胎的发育潜能，其中A366部分克服了在原核阶段检测到的重编程缺陷。
讨论
哺乳动物早期胚胎中正确的表观遗传重编程对细胞命运的确定和随后的发育潜力至关重要。在这项研究中，我们构建了小鼠ROSI胚胎的单细胞多组学景观。在此背景下，我们从转录组、甲基组和染色质可及性水平对ROSI胚胎的缺陷进行了解剖。值得注意的是，通过询问这些多层信息，我们发现了ROSI胚胎的重编程缺陷，这些缺陷与一组小ZGA基因的错误表达（下调）有关。我们发现这些缺陷可以在一定程度上被A366处理所克服，其中A366处理可以使总体发育率提高约两倍。先前的一项研究表明，辅助生殖技术——与DNA甲基化相关的变异可以在出生前后得到很大程度的解决(41).同样，早期胚胎的新染色体不稳定性也会在很大程度上从胚胎生殖层消失(42,43).考虑到在非干预性ROSI组观察到不良的发育结果，本研究中发现的重编程缺陷很可能无法自发消除。
在几种重建胚胎或人工多能干细胞中存在重编程障碍。例如，体细胞核移植（SCNT）胚胎存在DNA甲基化和组蛋白修饰重编程障碍(44–46).因此，使用抑制剂或关键酶的表达可以有效地促进SCNT胚胎的发育(44,45).值得注意的是，H3K9甲基化在多能性建立中起着重要作用(44,47)尤其是组蛋白H3赖氨酸9三甲基化在哺乳动物SCNT重编程过程中起重要的表观遗传屏障作用。同样，先前的研究也观察到ROSI胚胎在原核阶段存在异常DNA甲基化和H3K9甲基化(18,19);然而，有关ROSI胚胎表观遗传异常的系统描述，尤其是受精后，仍然缺乏。在本研究中，我们发现了早期圆形精子细胞重建的ROSI胚胎的重编程缺陷。ROSI与SCNT的显著差异是：ZGA发生时SCNT胚胎发育缺陷；因此，我们推测，在ROSI胚胎中发现的缺陷可能不会严重到阻碍主要ZGA的完全启动(29,48).ROSI胚胎的重编程缺陷很可能与一组小ZGA基因的错误表达相关，但这两个事件之间的因果关系仍不确定。推测早期精子细胞异常的表观基因组可能决定了ROSI胚胎的发育命运，H3K9me2沉积在雄性原核中就是一个例证。我们用EHMT2抑制剂A366处理ROSI胚胎确实可以提高其发育潜能，这与先前的研究结果一致，即降低H3K9甲基化可以提高ROSI胚胎的发育潜力(49).我们不排除ROSI胚胎存在其他固有缺陷的可能性。即使使用A366处理，ROSI胚胎的发育潜能也没有恢复到ICSI对照组的水平，表观基因组重编程仍然没有完全完成。随着在极低输入下测量组蛋白修饰的技术的发展(50)因此，本研究发现的ROSI胚胎重编程缺陷是由组蛋白修饰决定的，还是由圆形精子细胞遗传的其他组蛋白或DNA修饰作为其他潜在的重编程缺陷，将是很有希望的。这里，请注意，由于本研究中单细胞多组分分析中使用的细胞数量有限，因此可以观察到单个细胞之间的基因组覆盖率变化。
小ZGA对哺乳动物早期胚胎发育有重要作用(29).先前的一项研究表明，内聚素阻碍了SCNT胚胎中的小ZGA，在这种情况下，基因组的三维染色质结构发生了异常的重编程(31).染色质相关过程和DEGs在原核期的富集表明，来自早期圆形精子细胞的ROSI胚胎也可能像SCNT胚胎一样存在3D染色质结构缺陷。亲本基因组在各种表观遗传特征中经历不对称重编程，如DNA甲基化、染色质可及性和H3K27me3水平(51–53).此外，雄性和雌性原核内的重编程因子是不同的(54).尽管这些修饰大多在受精时被解决，但在重编程过程中父母的偏向逃避对于建立等位基因特异表达模式至关重要。需要进一步的研究来了解ROSI雄性原核（来源于早期圆形精子细胞）中穿梭因子是如何在雌雄原核之间交换信息的。验证人类ROSI胚胎中是否也存在类似的重编程缺陷，以及是否可以通过A366治疗来消除它也将是一个有趣的问题。
