简介 端粒是保护线性染色体自然末端的重复核苷酸序列( 1). 端粒在衰老中的确切作用仍然是一个争论的问题。 细胞分裂过程中连续的端粒磨损提供了决定复制寿命的分子机制( 1, 2)最终导致细胞衰老。 端粒缩短被认为是一种肿瘤抑制机制( 2, 三). 复制过程中的连续端粒磨损( 4)当端粒严重缩短，导致细胞周期停滞和复制性衰老时，最终触发DNA损伤反应。 据信，这种机制在人类和其他大型长寿物种中起到抑癌作用( 2)以牺牲晚年可能产生的负面影响为代价( 5). 临床观察支持这一概念，因为大多数临床可检测到的癌症已经激活了端粒酶( 1). 然而，关于复制性衰老的功能和生理作用仍有许多争议。 一个主要原因是端粒磨损的双刃剑作用( 6). 端粒的过度缩短本身就是致癌的。 短端粒存在于癌前，可能增加小鼠的遗传不稳定性和肿瘤形成( 7).
2001年，一种称为端粒位置效应（TPE）的过程，即端粒基因的可逆性沉默，在人类HeLa细胞中用荧光素酶报告器进行了研究( 8). 通过培养成肌细胞和成纤维细胞共鉴定出16个基因，这些基因在年轻细胞（端粒较长）和老细胞（端粒较短）中有差异表达。 这些基因大多在年轻细胞（端粒较长）中沉默，当端粒较短时就会表达（表S1）。 短端粒细胞外源性表达h 第三者 基因（活性端粒酶）导致的表达模式与具有长端粒的年轻细胞相似( 9, 10). 由于沉默机制是通过距离端粒至少15MB的环状结构起作用的，实验证明这五个基因， C1S公司 , 数字信号处理器 , ISG15 ( 10, 11), 山梨2 ( 9)，和 赫特 ( 12)称为长距离端粒位置效应（TPE-OLD）( 图1A). 关于TPE-OLD的功能细节知之甚少。 通过端粒长度（TL）以一种先发制人的方式调节基因的能力，例如，在没有诱导来自极短端粒的强烈DNA损伤信号的情况下，可能对精细的年龄依赖性调节的调节具有重要的意义，这促使我们更详细地研究这些相互关系。
图1 TPE-OLD概念和蛋白磷酸酶2A全酶亚基作为TPE-OLD候选。
( A )TPE——旧概念。 端粒可以循环到特定的位点来调节基因表达，这个过程被称为“长距离的端粒位置效应”( 9, 10, 12). 这种效应延伸到距离端粒至少15毫巴的距离，并可能以年龄依赖的方式调节基因表达。 ( B )构成PP2A全酶的结构（Aα和Aβ）、调节（B、B′、B〃、B?）和催化（Cα和Cβ）亚基的示意图。 该酶由两个同源催化亚基中的一个、两个同源结构亚基中的一个和至少15个高度可变的调节亚基中的一个组成。 包括的表格总结了调节亚单位的功能作用。 红色箭头表示TPE-OLD候选者，所有显示类似的调节功能，如所示( 21– 24). 丝裂原活化蛋白激酶； ERK，细胞外信号调节激酶。
我们用生物信息学的方法来鉴定TPE-OLD候选基因，并研究了高群体倍增（PDs）（短端粒）和h 第三者 永生化成纤维细胞（端粒较长）。 以Hutchinson-Gilford早衰（HGP）患者的成纤维细胞作为端粒加速磨损的模型。 HGP细胞端粒较短，TL分布异常( 13, 14). HGP患者在年轻时有许多正常衰老现象，但癌症发病率较低，无年龄相关性神经退行性变( 15). 我们确定了2322个TPE-OLD候选基因，其中许多与细胞周期控制、代谢调节和应激反应有关。 我们用了其中一个候选人( PPP2R2C型 )为了揭示端粒磨损与肿瘤抑制机制之间的机械联系，肿瘤抑制机制在端粒驱动的DNA损伤信号发生之前就已经起作用，从而根据雷帕霉素（mTOR）信号的减弱哺乳动物靶点，驱动肿瘤抑制作用。 PPP2R2C型 编码PR55γ，丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶（PP2A）的调节亚单位，具有多种参与细胞周期和代谢调节的底物( 图1B) ( 16, 17). 我们的研究结果表明TPE-OLD在衰老细胞中起着重要的作用，并支持复制性衰老实现肿瘤抑制功能的假说。
结果 基因组定位保守分析确定了先前未被确认的TPE-OLD候选基因 我们首先利用生物信息学的方法来鉴定可能受TPE-OLD影响的候选基因。 从生物学机制来看，大多数现象都是渐进的，复制性衰老物种与其他物种之间的区别也可以预期是渐进的。 虽然有些物种“明显在复制性老化”，但在许多情况下，这一属性很难被指定。 因此，在选择物种时，我们采用了最简单的定义。 按照Gomes先前提出的“假定TL依赖性复制衰老”的分类标准是TL<20kb、端粒酶水平不可检测、无停滞（应激相关衰老） 等 . ( 18). 利用这些标准，我们注意到文献中报道的16个已知或建议的TPE-OLD基因( 9– 12)在“复制性衰老物种”中，也就是说，在经历TL依赖性复制衰老的物种中，似乎在两个端粒位置上都被保存下来( 18)包括灵长类和非灵长类（0.2到7.5 Mb和13到17 Mb）( 图2A以及图S1）。 在不经历TL依赖性老化的生物体中没有观察到这种保护。
图2 已知TPE-OLD基因的保守基因组位置和编码PP2A亚基的TPE-OLD候选基因的鉴定。
( A )已建立的TPE-OLD基因的端粒距离。 这张图显示了在文献中已经提出TPE-OLD的所有基因到最近端粒的距离，上限为20 Mb。 基因以其符号和颜色来区分。 物种是水平分开的，按基因组中所有基因到端粒的中间距离排序。 仅显示了与端粒的中间基因距离大于15mb的物种，这接近已建立的TPE-OLD基因与端粒的最大距离。 拟复制老化的物种[如结果和( 18)]在左边分组。 图中所示的数据可作为一个参考，用于保存低于20毫巴的端粒距离，以及复制性和非复制性衰老物种之间的差异，这些差异可以预期为TPE-OLD基因。 我们发现，已建立的TPE-OLD基因之间的端粒距离在物种间被保存，因此这些基因在左边显示为水平模式。 基因名后面括号内的数字表示编码该基因的人类染色体。 ( B )PP1A和PP2A亚单位中TPE-OLD候选基因的端粒距离。 这张图显示了聚集在20毫巴以下的基因。 这里研究过的四种基因在传说中有标记。
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我们利用Ensembl基因组数据库筛选出与这组已建立的TPE-OLD基因具有相似保守位置的其他基因。 我们根据位置守恒原则选择了可能的候选者，间距不超过1MB，并且在距离端粒17MB以内的任何地方，例如文献中讨论的TPE-OLD效应的最大距离。 使用这种方法，我们确定了2322个新的TPE-OLD候选者（图S3和表S2）。 基因集富集分析发现，许多候选基因参与增殖、代谢和应激反应，和/或受参与增殖、代谢、发育、应激反应和DNA损伤反应的转录因子调控（表S3）( 19, 20). 因此，与转录调控、细胞生长和应激反应相关的基因家族在TPE-OLD候选群体中的比例过高（表S4）。 因此，衰老细胞中这些基因活性的变化可能表明了一个受调节的适应过程，这促使我们更密切地研究TPE-OLD候选基因中排名靠前的一组。
细胞生长调节剂PP2A的几个调节亚单位基因是TPE-OLD候选基因 针对与细胞生长和衰老密切相关的基因，20个TPE-OLD候选基因编码丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶PPP1、PPP2和PPP6亚基，并显示出典型的端粒位置保守性( 图2B无花果。 S2至S3）。 这些ppp编码细胞分裂、蛋白质合成和肿瘤抑制的关键调控因子。 最丰富的酶PP2A在某些组织中占细胞总蛋白的1%，有300多种底物参与细胞周期和代谢，调节主要的细胞周期途径和检查点( 16, 17). PP2A磷酸酶的全部活性、底物特异性和亚细胞定位是由不同的调节亚基决定的( 图1B) ( 16, 17). 我们观察到虽然催化亚基( PPP2CA公司 和 PPP2CB型 )具有较高的序列保守性，其染色体位置在种间不保守性； 相比之下，许多调控亚基基因的端粒距离在序列上更为多样，在具有TL依赖的复制衰老的物种中趋于保守。 我们特别注意到PP2A的四个调节亚基，即， PPP2R2C型 , PPP2R2D型 , PPP2R5C ，和 PPP2R3B ( 21– 24)，在所建议的TPE-OLD范围内，在与端粒相对的不同位置局部保存（图S4）。 在不经历TL依赖的复制衰老的物种中，没有观察到这些基因的端粒保存（或染色体位置的任何其他保存）( 图2B以及图S4）。 鉴于这些观察结果和PP2A在细胞周期调控中的作用，我们在下一个实验中将这四个PP2A调节亚单位基因作为TPE-OLD候选基因进行研究。
PP2A调节亚基基因的表达 PPP2R2C型 在健康的早熟成纤维细胞中显著上调，但在应激性衰老中不上调 我们检测了在旧的但仍在复制（早期）细胞中端粒相关的基因表达和细胞生理学的变化。 原代细胞的衰老阶段（高PDs后达到）是通过培养细胞直到最终细胞周期停止，对于实验而言，在建议的最终停止前将冷冻样品从10到15 PDs解冻。 早期成纤维细胞已经缩短了端粒[TLR比率（TLR）为0.15到0.24，而TLR在其年轻衍生物中为0.48到0.81]，但还没有出现典型的衰老细胞迹象，即使它们的生长速度已经减弱（生长曲线如图S5所示）。 将这些细胞与各自复制的年轻健康细胞进行比较。 对HGP患者的细胞也进行了同样的处理，这些细胞被认为是加速端粒磨损和早衰的模型( 13). 采用已建立的聚合酶链反应（PCR）方法，将TL量化为相对TLR，并与单拷贝基因标准进行比较。 成纤维细胞系被分类为“年轻的初级对照细胞”（低PDs 13到17，TLR 0.48到0.81），作为“早期初级控制细胞”（高PDs 41到55，TLR 0.15到0.24），被归类为“年轻的原代HGP细胞”（低PDs 19到20，TLR 0.28到0.68）， 或作为“早期原代HGP细胞”（高PDs 34至42，TLR 0.17至0.46；表S5）。
首先，我们比较了年轻人所有相关PP2A亚基的TL和基因表达水平（L代表低PD in 图3以及图S6）和预成（H表示高PD in 图3图6）健康对照组和HGP成纤维细胞。 具体地说，我们分析了四个PP2A调节亚单位，它们似乎保存在TPE-OLD范围内，位于端粒的不同位置( PPP2R2C型 , PPP2R2D型 , PPP2R5C ，和 PPP2R3B )，两个结构( PPP1A型 和 PPP1B型 )，以及两个催化亚单位( PPP2CA公司 和 PPP2CB型 ).
图3 控制（CON）和早熟（HGP）成纤维细胞中调节、结构和催化PP2A亚基的TL依赖性mRNA水平。
( A )原发性肝癌的定量PCR（qPCR）分析( ? hTERT）和永生化（+hTERT）对照（CON）和HGP细胞在低（L）和高（H）PD下。 亲环素A 作为标准化对照。 WFS1型 和 HTT公司 代表内部控制， 第21页 表示应力标记，并且 TBC1D3 表示潜在的混杂因素，如结果中所述。 所有数值均标准化为L PD时细胞中mRNA的水平（=100%），结果显示为平均值±SEM。Mann-Whitney 美国 试验使用：* P <0.05和** P <0.01的L-PD和H-PD。2394次测量中有6次被排除在外，因为mRNA无法检测。 ( B )平均TL和 PPP2R2C型 前1、H期CON和HGP细胞mRNA水平的变化( ? 在（+hTERT）永生化之后。 如材料和方法中所述，使用单色复合qPCR（MMqPCR）测量TL作为相对TLR。 mRNA值标准化为（=100%）的水平 PPP2R2C型 原代L-PD细胞的mRNA。 结果以平均值±标准差表示* P <0.05和** P 小于0.01，L PD与H PD## P <0.01对于+hTERT与 ? hTERT（Mann-Whitney U检验）。 （A）和（B）中的每项分析均为生物四份和技术三份。 ( C )TL与 PPP2R2C型 mRNA水平。 所有的数值都被标准化为细胞系707在L PD时的mRNA水平（=100%） n =16个细胞系[8个原代细胞和8个永生化（T）]，不包括一个检测不到mRNA的细胞。 FC，换衣服。
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TL对任何结构或催化亚基的基因表达无影响( 图3). 在调节端粒PP2A亚单位基因中， PPP2R2C型 在端粒较短的健康成纤维细胞中，mRNA水平持续上调（6.85±1.79倍， P ≤ 衰老前5～15pds时为0.01），有一些跨期和个体间的变化（最小/最大观察到的折叠变化为2.76倍/16.99倍）。 PP2A亚基基因 PPP2R2D型 , PPP2R5C ，和 PPP2R3B 在这里描述的条件下，成纤维细胞没有上调( 图3A)因此没有进一步分析。 在HGP患者的成纤维细胞中， PPP2R2C型 mRNA水平增加了2.03±0.27倍， P ≤ 0.01，高PD细胞相对低PD细胞( 图3A)（观察到的最小/最大褶皱变化为1.03倍至3.28倍；图S6）。
接下来，我们测量了h 第三者 -永生化细胞（即具有人工延长端粒的细胞）在低和高PDs。 最近被永生化的细胞被归类为“低PD时的永生细胞”（h后PD 14到28） 第三者 TLR为0.6～1.18的健康细胞永生化； h后PD 15至34 第三者 在TLR为0.67～1.44的HGP细胞中永生化，以及永生化后具有大量PDs的细胞被归类为“高PD下的永生化细胞”（h 第三者 TLR为1.59～2.91的健康细胞永生化； h后PD 57至63 第三者 TLR为0.87～2.74）。
不朽之后 PPP2R2C型 健康成纤维细胞的mRNA水平下降到年轻细胞甚至更低（0.4±0.3倍对6.8±6.2倍， P ≤ 0.01）( 图3B). 在HGP成纤维细胞中 PPP2R2C型 h组mRNA水平下降至基础水平以下 第三者 -永生化HGP成纤维细胞（0.3±0.2倍对2.0±0.9倍， P ≤ 0.01），但有明显的延迟（仅在永生化后的高PD）。 我们一起发现 PPP2R2C型 对照组和HGP成纤维细胞的表达及TL( 图3C).
除了复制性衰老外，还有一些因素可以加速和/或触发细胞衰老，包括各种形式的应激，如氧化应激。 这种急性应激主要不是由端粒缩短引起的，可能完全独立于TL和复制性衰老( 25, 26). 使用亚致死H 2 O 2 浓度，我们触发应激性衰老来研究这里描述的现象的特异性。 应用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21监测应激诱导的早衰（SIPS）( 27). 我们用H刺激成纤维细胞 2 O 2 在能够引起典型应力反应（SIPS）的浓度下，如诱导 第21页 mRNA（图S6）和细胞应激标记物β-半乳糖苷酶[即衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）]（图S7）。 SA-β-半乳糖的测量还通过高灵敏度的分光光度法[4-甲基伞形花基-β]得到证实- d -半乳吡喃糖苷（MUG）]，SA-β-Gal染色和主观视觉定量的替代品，可测量细胞裂解物中的酶活性。 我们观察到 PPP2R2C型 在一些实验中发现在mRNA水平上H 2 O 2 刺激没有引起显著的 PPP2R2C型 mRNA增加（图S6），但它确实增加了SA-β-Gal的测量值，这表明氧化应激不是 PPP2R2C型 mRNA表达。
这些数据表明PP2A调节亚基基因的表达 PPP2R2C型 在健康的早期成纤维细胞中明显上调，但在SIPS中不上调。 我们发现 PPP2R2C型 HGP细胞中mRNA的表达与健康对照组比较，但与TL和HGP细胞中TL和HGP之间的反向关系没有明显偏离 PPP2R2C型 表达式。
组蛋白依赖的端粒环化而不是长程异染色质扩散是导致 PPP2R2C型 接下来我们有兴趣探索端粒缩短与 PPP2R2C型 mRNA表达。 经典热塑性弹性体 酿酒酵母 和 黑腹果蝇 通过异染色质扩散，以与端粒重复序列的接近程度成比例的方式调节基因，在较长的端粒距离上无效( 28). 为了排除TPE的持续传播（如经典的TPE），我们检测了位于 PPP2R2C型 还有端粒。 我们没有发现TL与基因表达之间的相关性，比如 WFS1型 和 HTT公司 与衰老和生存也有一定的功能关系( 29, 30)在有或没有hTERT永生化的高PD和低PD细胞中( 图3以及图S6）。 因此，端粒磨损没有影响 WFS1型 或 HTT公司 表达，尽管这些基因的染色体位置比 PPP2R2C型 这表明异染色质的长程传播并不是导致细胞沉默的原因 PPP2R2C型 .
接下来，我们检查端粒缩短是否会引起染色质组织的改变，包括 PPP2R2C型 轨迹。 根据TPE-OLD的概念，早期细胞中有一个由长染色体形成的环状结构，随着端粒的缩短，这种结构会打开甚至完全消失。 因此，当染色体重组发生在端粒较短的细胞中时，人们期望分离的探针百分比更高（“S”；探针之间的距离>2.26μm），相邻探针的百分比更低（“a”；探针之间的距离<2.26μm）。 我们使用高分辨率三维荧光原位杂交成像（3D-FISH）测量细菌人工染色体（BAC）探针之间的距离 PPP2R2C型 基因座（红色；距端粒4.2MB）和一个包含保守的4p亚区的终末期探针（绿色； ～ 距端粒100-300kb； 图4). 与我们提出的机制相一致，我们观察到长TLs和短TLs细胞中两个基因座之间的距离的总体分布有一个持续且非常显著的变化( 图4无花果。 S8和S9）。 即使我们分别检查每个细胞系的最短和最长探针距离（图S8D），以纠正成纤维细胞中TLs的已知双峰分布，这种模式仍然存在( 31).
图4 .识别 PPP2R2C型 作为TPE-OLD基因：染色体重组。
( A )用长端粒和短端粒显示TPE-OLD效应。 ( B )用IMARIS处理的3D-FISH共焦图像。 灰色，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）； 绿松石，BAC RP11-762B2靶向基因 PPP2R2型 C； 洋红色，TelVysion（TEL）探针，靶向亚染色体4p（距4p染色体端粒100-300kb）。 A、 相邻的； S、 分开了。 ( C )电话总体分布- PPP2R2C型 健康对照细胞和早熟细胞的探测距离。 探头距离的比例 ≤ 2.26μm和>2.26μm如圆图所示。 实验次数包括所有数据点，扣除少于或超过四个信号点（而不是每个信号点有两个红色和两个绿色信号）、不规则的DAPI染色（如有丝分裂细胞）和异常细胞形状（总共1680个距离中的252个被排除在外）。 DAPI采用405 nm激发/415-480nm发射，光谱绿采用488nm激发/500-545nm发射，光谱橙采用561nm激发/565-640nm发射获得图像。 然后使用imaris9.3软件（和或位平面）处理图像。
在酵母中，端粒基因的表达通过染色质修饰来调节，以应对饥饿和热休克应激，是一个重要的调控网络的一部分( 28). 此外，端粒染色质的变化与细胞衰老有关( 32). 哺乳动物细胞中的异染色质通常依赖于组蛋白去乙酰化。 因此，我们研究了组蛋白修饰干扰物质处理对 PPP2R2C型 mRNA水平（图S10）。 用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A（TSA）治疗后，我们没有发现明显的变化( 33)我们也没有发现用5-氮杂胞苷（5-AzaC）处理成纤维细胞后的变化，这导致非特异性的整体DNA去甲基化，从而导致基因组组蛋白修饰模式的重组( 34). 白藜芦醇（Resveratrol，RSV）可能导致端粒DNA不稳定( 35)，略有增加 PPP2R2C型 h的mRNA水平 第三者- 永生化成纤维细胞，高达1.6倍。
由于TSA、5-AzaC和RSV缺乏特异性，我们的目标是寻找一种更为特异的调制方式。 在 S、 酿酒 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰基酶Sir2（沉默信息调节器2）在端粒附近产生和维持沉默染色质中起着关键作用( 36). 这种端粒近端基因的表观遗传沉默随着复制酵母的老化而丧失，同时伴随着近端序列的异常高乙酰化。 哺乳动物的Sir2同系物sirtuin6（SIRT6）最近被证明是抑制内源性端粒近端基因所必需的，这表明SIRT6在维持自然端粒处具有沉默能力的染色质结构中起着关键作用( 37). 化合物BCI-150，一种新的SIRT抑制剂，对SIRT6有选择性，但对SIRT1和SIRT2没有选择性( 38)，增强了 PPP2R2C型 高达5倍 第三者 -永生细胞（图S10）。 因为在人类细胞中，SIRT6被发现是抑制端粒近端报告基因所必需的( 37)，这一发现表明 PPP2R2C型 依赖于SIRT6介导的组蛋白去乙酰化。
P70S6K的去磷酸化和下游效应与成纤维细胞的分化直接相关 PPP2R2C型 上调与基础mTOR水平无关 蛋白质由 PPP2R2C型 （PR55γ）通过去磷酸化抑制mTOR下游靶点p70S6K( 21). p70S6K与S6核糖体蛋白（S6RP）、起始因子和4E结合蛋白1一起是mTOR最重要的下游靶点 389 磷酸化状态与其体内激酶活性密切相关( 39).
在早期人成纤维细胞中，端粒磨损与p70S6K磷酸化水平显著降低相关，为年轻健康对照细胞水平的16±6%( 图5A). 以前的研究表明，抑制p70S6K可间接降低Akt磷酸化( 40). 因此，我们观察到处于磷酸化状态的Akt蛋白在早期健康对照组和（程度较低）HGP细胞中水平较低( 图5C). 端粒酶使细胞永生化，恢复了细胞生长（图S5），也恢复了p70S6K磷酸化模式( 图5A)以及Akt磷酸化模式( 图5C)以TL依赖的方式在两种细胞类型中（图S11）。
图5 TL对mTOR信号的影响。
( A 到 C )（A）p70S6K、（B）mTOR和（C）Akt的总蛋白和磷酸化蛋白水平。 免疫印迹分析从原代开始( ? h 第三者 )和h 第三者 -永生化细胞（+h 第三者 )在低（L）和高（H）PDs下，在没有或存在H的情况下 2 O 2 （200μM；2小时），如图所示。 浅灰色柱，健康的CON成纤维细胞； 深灰色柱，HGP成纤维细胞。 所有的蛋白质水平被标准化为β-肌动蛋白的蛋白水平。 蛋白质/β-肌动蛋白比值与低PD细胞样本（设定值为1）相比表达。 平均值±SEM， n =每列4个细胞株（每个柱有2到3个独立的印迹）。 每个β-肌动蛋白与各自的蛋白质属于同一膜（图S21）。 ( D )TPE-OLD的保护作用示意图 PPP2R2C型 （PR55γ代表蛋白质）诱导。 ( E )Akt/mTOR/p70S6K通路示意图。 PR55γ介导的p70S6K去磷酸化对蛋白质合成有直接的抑制作用，因此可以稳定细胞的衰老状态。 p70S6K的抑制还可能导致Akt磷酸化程度降低( 40). 洋红色，癌基因； 绿松石，肿瘤抑制剂； 灰色，没有特征。 PI3K，磷脂酰肌醇3激酶； 4E-BP1，4E结合蛋白1。
mTOR介导并整合生长信号； 因此，mTOR和蛋白质合成受到严格的调控，并与细胞的生长速度相结合。 我们研究了低p70S6K磷酸化程度发生在较低的蛋白质合成需要和较低的生长相关mTOR和p70S6K活性的可能性。 因此，我们将细胞生长速率与Akt、mTOR和p70S6K的蛋白质量联系起来（图S12）。 我们没有发现生长速度、mTOR、p70S6K和Akt的表达以及p70S6K磷酸化程度之间的关系。 相比之下，生长速率降低的HGP成纤维细胞的相对mTOR、p70S6K和Akt蛋白水平比对照组高出约两倍。 尽管这种不适当的高mTOR活化，p70S6K的失活脱磷作用没有受到干扰，而是得到了增强（图S12中的红色箭头）。 在另一个实验中，我们检测了血清饥饿对p70S6K和mTOR蛋白及mRNA水平的影响。 如图S13所示，此处理导致p70S6K和mTOR水平略有降低，然而，其降低远低于TL依赖的上调 PPP2R2C型 导致衰老细胞p70S6K磷酸化降低。 因此，血清饥饿不是早期成纤维细胞p70S6K磷酸化的主要决定因素。
苏氨酸磷酸化 389 激活p70S6K并通过S6RP的磷酸化增加细胞蛋白质合成； 相应地，去磷酸化抑制蛋白质合成。 抑制mTOR（和p70S6K）会降低许多代谢靶点的蛋白质水平，从而减缓衰老进入。 因此，我们分析了原代早期细胞中的代谢标志物芳基硫酸酯酶A（ARSA）。 ARSA的蛋白质产物（图S14，右图）和由此产生的活性（中间面板），其由mTOR和p70S6K调节，并被原型mTOR抑制剂雷帕霉素强烈抑制( 41)在老年人成纤维细胞中，抑制细胞凋亡。
进一步确认 PPP2R2C型 在成纤维细胞p70S6K磷酸化中，我们使用 PPP2R2C型 -特异性小干扰RNA（siRNA）。 在用siRNA（25和50nm）处理早期成纤维细胞7小时和去除siRNA后48小时的孵育时间后，HGP细胞中p70S6K的去磷酸化被大约90%的抑制（图S15）。 同时，观察到转录可能依赖p70S6K磷酸化的基因的mRNA水平增加，p70S6K的总量适度减少。 综上所述，这些研究结果与p70S6K上的数据一致，表明TL依赖于p70S6K的上调 PPP2R2C型 导致衰老细胞代谢和增殖抑制。 我们的数据支持PR55γ的概念 PPP2R2C型 ，导致p70S6K的去磷酸化，从而有助于抑制具有短端粒的早期成纤维细胞的细胞功能。
TL相关的消声 PPP2R2C型 尽管端粒磨损动力学异常，HGP成纤维细胞可能的下游效应并未受到严重影响 以HGP患者的成纤维细胞作为提示加速端粒磨损的模型。 HGP成纤维细胞的TL平均值略短于正常值，TL分布异常。 大约三分之一的细胞都有正常甚至更长的端粒( 13, 14). 因此，我们假设TPE的变化至少可以部分解释这些与衰老相关的现象。 然而，我们可以排除TPE-OLD的严重异常（对于 PPP2R2C型 )在HGP。
p70S6K在早期HGP细胞中几乎完全不磷酸化( 图5A); 我们观察到TL和 PPP2R2C型 mRNA表达( 图3C)在端粒较短的老年HGP细胞中，p70S6K发生去磷酸化( 图5A)尽管这些细胞中总mTOR蛋白水平持续高水平（图S12），这排除了TL依赖性沉默的严重异常 PPP2R2C型 通过TPE-OLD。
然而，在HGP细胞中也有一些微妙的“端粒功能障碍”的迹象。 例如，在HGP患者而非对照组的细胞中，年轻细胞的端粒往往较短（低PD时TLR为0.49±0.08，对照组为0.68±0.07； P =0.1），但在早期细胞中较长（TLR为0.33±0.08，高PD时为0.19±0.02； P =0.2）( 图3B). HGP成纤维细胞中TL依赖的染色体重组与对照组相比略有差异（约10%），但无显著差异（表S6）。 与异常TL分布一致，HGP细胞系中检测到的其他特征具有更高的可变性。 两个HGP细胞系（hgadfn127和HGADFN 164）仅显示中度染色体重组，而第三个细胞系（HGADFN 178）显示出所有细胞中最严重的重组（图S9）。 此外，我们发现 PPP2R2C型 与健康对照组相比，HGP细胞的mRNA水平（2.03±0.27比6.85±1.79倍， P =0.02； 图3B)与对照组相比，HGP细胞对Akt磷酸化的抑制降低（青年细胞中磷酸化水平为41±11%对2±1%， P =0.029； 图5C). 我们还观察到更高的总增殖率（图S5和S16），mTOR靶ARSA的活性水平大约高出2倍( P =0.04），与对照细胞相比，ARSA蛋白水平高出约1.5倍（差异不显著）（图S14），与更高程度的衰老相关。 原代HGP细胞比健康对照细胞在较少的复制周期后生长更快并衰老（图S5）。 我们观察到在G 2 -衰老细胞典型的细胞周期的M期（图S14）( 42)衰老标志物MUG和SA-β-Gal水平升高（图S7），衰老时mTOR水平升高，以及 TBC1D3 ( 图3图6），EGF受体反应的放大器。 总之，这些发现表明HGP细胞比对照细胞有更高的增殖压力。 虽然TPE-OLD有严重异常（对于 PPP2R2C型 )可以排除，TL异质性和/或功能障碍可能导致TPE-OLD动力学改变，从而导致更高程度的增殖应激。
TL相关的消声 PPP2R2C型 并在其他细胞类型和来自老年细胞供体的成纤维细胞中建立了TPE-OLD候选物 研究TL依赖性表达 PPP2R2C型 在不同的人类细胞类型中，我们评估了 PPP2R2C型 从柏林衰老研究II（BASE-II）参与者的B淋巴细胞建立的413个淋巴母细胞系（LCL）中检测TLs( 43, 44)采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和单色多重定量PCR（MMqPCR）方法对上述成纤维细胞进行检测。 LCL有望代表具有非常广泛TL分布的细胞。 使用这个细胞群，我们没有观察到 PPP2R2C型 表达式和TL（图S17）。 我们也没有发现其他TPE-OLD候选基因在LCLs中的mRNA表达增加。 在原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，我们发现mRNA表达上调 PPP2R2C型 , PPP2R2D型 , PPP2R5C , C1S公司 ，和 山梨2 ; 我们发现了一个相互调节（衰老细胞中较低的mRNA水平）的 数字信号处理器 无显著变化或无结论性结果 第三者 , ISG15 ，和 PPP2R3B （图S18）。 在人成纤维细胞中，我们可以证实大多数先前建立的TPE-OLD基因表达存在差异（在端粒较短的老化细胞中高表达），但我们不能显示对 PPP2R5C , PPP2R2D型 ，和 PPP2R3B 这些数据共同表明TPE-OLD的细胞特异性和/或其他因素可能影响这些TPE-OLD基因的表达，特别是在LCL中（图S18）。
我们最后问是否 PPP2R2C型 在体内也起作用，因此比较了从非常年轻到非常老的人的成纤维细胞。 我们发现 PPP2R2C型 与年轻和中年细胞供体相比，非常老供体的细胞明显更为明显，这进一步表明了衰老机体的生理功能，体外复制性衰老类似于体外衰老（图S19）。
讨论 一个简单的工具预测已知的和候选的TPE-OLD基因 我们提出了一个启发式策略，可以用来识别潜在的保护性TPE-OLD候选基因。 这些候选基因中的大多数还不知道参与衰老或凋亡的进入，而是编码参与增殖、代谢、肿瘤抑制和应激反应的蛋白质。 此外，许多TPE-OLD候选基因受参与增殖、发育和应激反应的转录因子调控。 例如，AP2转录因子家族的功能是细胞类型特异性的增殖刺激和末端分化的抑制( 45). Sp1既能激活和抑制一些重要的癌基因和抑癌基因的表达，也能激活和抑制与增殖、分化、DNA损伤反应和衰老有关的基因的表达( 46).
在与基因本体论（GO）术语“端粒染色质沉默”（GO:0006348）相关的11个人类基因中，只有1个在TPE-OLD候选基因组中被发现， DOT1L公司 ，编码组蛋白H3K79甲基转移酶，对哺乳动物异染色质结构至关重要。 因此，这里所描述的2322个基因可能属于一个以前未知的类别，其调控依赖于TL。我们的工具允许其他研究人员识别和研究可能的TPE-OLD基因，以用于未知的抗肿瘤和抗衰老策略。
蛋白磷酸酶2A亚基PR55γ的编码基因( PPP2R2C型 )是一个TPE-OLD基因，在人成纤维细胞中受端粒长程调控 PPP2R2C型 上调依赖于端粒的磨损，而不依赖于外源性应激触发，如H 2 O 2 端粒伸长可实现基因完全沉默。 通过3D-FISH分析，我们发现- PPP2R2C型 与短端粒细胞相比，端粒较长的细胞中探针的距离明显更近，表明端粒依赖性染色质重组。 根据其他研究，TPE-OLD基因表达的变化是不连续的（例如，不涉及靠近端粒的基因），并且在h 第三者 引入时有一些延迟（因为延长需要一段时间）( 47).
值得注意的是，BCI-150，一种新近开发的SIRT抑制剂，对SIRT6和SIRT1和SIRT2具有选择性( 38)，增强了 PPP2R2C型 高达5倍 第三者 -永生细胞。 因为SIRT6是抑制人类细胞端粒近端报告基因所必需的( 37)，这一发现表明 PPP2R2C型 依赖于由SIRT6介导的组蛋白去乙酰化。3D-FISH实验中的双峰性表明，两条染色体都参与端粒环，这与所报道的成纤维细胞中TL的双峰分布一致，同源染色体之间的TL差异高达6.5 kb， 可能是由于端粒遗传中的随机因素( 31). 总之，这些发现证明了TPE-OLD和肿瘤抑制基因之间的机械联系，这种基因在端粒驱动的DNA损伤信号发生之前就起作用了。
端粒磨损导致p70S6K脱磷抑制mTOR信号传导 以前的研究表明 PPP2R2C型 通过抑制mTOR通路中S6K的活性抑制肿瘤细胞的增殖( 21). 反之亦然，低 PPP2R2C型 在前列腺癌中，表达与癌症复发和癌症特异性死亡率的增加有关( 48). 根据这些数据，我们发现 PPP2R2C型 上调导致早期但仍在复制的成纤维细胞中p70S6K几乎完全去磷酸化，我们发现TL和 PPP2R2C型 TL与p70S6K和Akt脱磷等级之间的表达。 p70S6K的去磷酸化可能通过代谢抑制延缓衰老进入。 雷帕霉素敏感蛋白的合成在早期成纤维细胞中受到抑制。 相反，抑制 PPP2R2C型 siRNA可在衰老细胞中重新导入mTOR/p70S6K依赖基因。 同时，我们观察到p70S6K蛋白总量下降，这可能是由于磷酸化依赖的降解事件，如前所述( 49). 然而，我们不能完全排除非特定的转染事件( 50). 使用CRISPR-Cas9技术的更具体和完整的敲除和过度表达策略可以进一步阐明 PPP2R2C型 .
扩张刺激信号与细胞分裂抑制的结合( 51)是一个众所周知的因素，在过渡到不稳定的高代谢状态，这可能发生在没有有效的下调细胞代谢( 52). 我们的数据证实了其他的发现，并提示p70S6K去磷酸化对早期细胞有整体的保护作用。 本文对这一分子途径和mTOR抑制的延寿效应进行了详细的讨论。 然而，到目前为止，大多数的发现都是通过对小鼠进行基因操作获得的( 53, 54)还有苍蝇( 55)或在人和啮齿动物细胞系或 秀丽隐杆线虫 我们展示了体内mTOR抑制的可能生理功能和机制，并确定短端粒是mTOR抑制的上游触发因素。
影响 PPP2R2C型 TL的调节支持复制衰老在体内实现肿瘤抑制功能的假设 这里描述的发现有力地证明了复制性衰老的肿瘤抑制功能。 我们在TPE-OLD的影响下鉴定了一个直接的肿瘤抑制基因。 一种减轻端粒磨损陷阱（即持续的有丝分裂压力）的保护作用是合理的，并支持复制性衰老的主要功能是抑制肿瘤的假说。 作为产生整体积极净效应（肿瘤抑制时间足够长）的先决条件，必须尽量减少复制性衰老可能带来的负面影响。 端粒磨损是遗传不稳定综合征( 56)尽管如此，一般不会对人类造成生命威胁，也不会对老鼠和老鼠造成威胁 C、 挽歌 ( 57– 59).
表达 赫特 基因本身可能受TPE-OLD的调控( 12)进一步指出端粒基因表达的调控作用。 基因沉默可能是胚胎发育后抑制非期望基因表达的一种机制。 这是很诱人的推测，但有待进一步的实验证明，这限制了 赫特 在端粒极短的细胞中，一般情况下端粒磨损可稳定细胞而不破坏肿瘤抑制作用； “温和” 赫特 上调和mTOR抑制可能协同作用来限制端粒极短的细胞的致瘤风险。 这些数据并不排除h 第三者 或者其他TPE-OLD基因可能会通过不受控制的转录去表达而对癌症的易感性产生矛盾的影响。
HGP成纤维细胞显示功能性 PPP2R2C型 TPE-OLD效应但端粒磨损动力学异常 我们的实验数据并没有显示HGP中TL依赖的染色体重组的严重缺陷。 因此，功能性染色体重组可以防止更糟糕的表型，这与HGP患者的低癌症发病率一致( 15).
尽管HGP成纤维细胞存在功能性TPE-OLD，但HGP细胞系表现出一些异常，如平均值降低 PPP2R2C型 mRNA水平，更高的增殖率，Akt抑制程度的降低，3D-FISH实验中TL的变异性增加，端粒变化不明显 PPP2R2C型 探测低PD细胞和高PD细胞之间的距离，以及代谢标记物ARSA的低抑制。 这些观察结果是可信的，因为在这项研究和其他研究中发现了热释光在HGP中的更大的异质性和异常的TL分布； 在其他研究中，尽管平均TLs较短，但在大约三分之一的细胞中，端粒正常甚至更长( 13, 14). 因此，我们在年轻的HGP细胞中检测到较短的端粒，而在早期细胞中甚至检测到更长的端粒，这与TL和 PPP2R2C型 表达式范围。 初级（但不是h 第三者 -转染）HGP细胞在较少的复制周期后生长更快，衰老更早（图S5和S16）。 基因激活/沉默的动态变化可能有助于减弱代谢抑制，这是众所周知的加速衰老进入( 52).
HGP成纤维细胞在体外老化更快，显示出mTOR信号的组成性激活，而p70S6K的去磷酸化明显完整。 初步数据显示，其他TPE-OLD基因的变化更为明显。 总之，这些数据表明了HGP的端粒异常，可能有助于解释为什么HGP患者不会发展成肿瘤，而是出现许多早衰迹象。 由于HGP患者的早期死亡，不能完全排除这些患者随着年龄的增长患癌风险的增加。 为了更密切地研究端粒临床表型之间的相互关系，从奈梅根断裂综合征患者的细胞中提取( 56)以染色体不稳定为特征的，可能会有所帮助。 在这些患者的成纤维细胞中，TPE-OLD中的端粒失衡也与加速端粒磨损有关( 56). 这些患者往往有类前激素症状，但与HGP患者相比，他们的端粒更短，遗传不稳定性更高，癌症发生率也很高。
TPE-OLD机制在进化上是保守的，可能是对复制性衰老的负面影响的反应 一些证据支持我们的假设，即TPE-OLD是对复制性衰老的进化保守反应。 首先，我们没有发现TPE-OLD基因在染色体末端的平均分布，表明端粒定位高度保守。 第二，TPE-OLD候选者在功能上有相似之处，通常参与增殖和代谢的控制或应激反应。 我们预计许多其他的基因 PPP2R2C型 随着人类和其他大型长寿物种的细胞衰老，TPE-OLD保护性激活。 我们观察到许多其他与压力和衰老有关的基因的端粒聚集，包括白介素（图S20）、肿瘤抑制基因和编码 狐狸 （forkhead box）参与胰岛素信号传导和寿命的转录因子和热休克因子1( 高铁F1 )，是蛋白质毒性胁迫的主要调控因子，但我们没有发现这种与发育有关的基因簇，如 霍克斯 基因或细胞死亡基因和炎症核因子NFκB的典型驱动因子，这与我们的观点一致，即TPE-OLD对早期细胞有效并触发保护过程，但不触发凋亡。 第三，与经典热塑性弹性体有明显的相似性。 经典TPE的主要功能是抗急性细胞应激。 尤其是， CDC55型 ，正射测井 PPP2R2C型 在酵母中，位于相对接近酵母端粒（<150000个碱基对）的位置，在这个位置，具有异染色质扩散和相邻基因沉默的经典TPE可以有效。 CDC55编码YGL190C，它可以去磷酸化并拮抗Tap42蛋白，介导雷帕霉素对酵母Tor蛋白激酶的影响( 60). CDC55在饥饿诱导的应激中稳定酵母细胞并下调代谢功能( 61). 这一机制强烈地让人想起p70S6K抑制对人体的代谢作用。 因此，我们认为酵母中的TPE和大型长寿物种中的TPE-OLD具有共同的功能和机制起源( 图6).
图6 TPE与TPE-OLD的相似性及可能的系统发育关系。
( A )酵母中的TPE-OLD和TPE可能具有共同的机理和功能。 在 S、 酿酒 ，在最佳生长条件下，大多数亚基因组基因被组蛋白结合沉默信息调节器（SIR）复合物沉默（在该物种中，在很大程度上独立于TL）。 营养缺乏、热休克或化学处理可诱导Sir蛋白磷酸化过度，随后沉默减少( 28). ( B )酵母中的TPE与哺乳动物和其他脊椎动物中的TPE-OLD在机制和功能上的相似性可能是由于共同的进化遗传，SIRT6（哺乳动物的Sir2同源物）保留了其祖先的作用，在年轻和生长的细胞中作为基因沉默的辅助因子，就像Sir2在酵母中作为沉默因子一样， 压力通过磷酸化事件作为其抑制剂。
TPE-OLD效应是细胞类型特异性的和/或可能显示进一步的调节水平 微分调节 PPP2R2C型 mRNA可用于HUVECs和成纤维细胞，但不适用于LCLs。 此外，大多数已知的TPE-OLD基因在HUVECs和成纤维细胞中的差异调节，但对LCLs却没有，这表明LCLs具有细胞特异性和/或特异性。
考虑到细胞类型的特异性，另外三个PP2A亚单位TPE-OLD影响相似的途径，并且都可能通过mTOR抑制来减弱细胞增殖( 图1B)，增加了这些亚单位在其他代谢状态或其他细胞类型中被诱导的可能性。 面肩肱型肌营养不良症的发现，遗传缺陷导致活性基因在端粒或近端粒序列附近重新定位，并且表型以年龄依赖的方式改变( 9)，提示TPE-OLD的细胞和组织特异性。 TL在不同的组织类型中差异很大( 62); 因此，相似的功能可以由不同的亚基来执行，这些亚基的基因组位置与它们各自的细胞类型的基本TL相适应。
对于不同细胞类型的不同发现，还有其他各种可能的解释。 剪接变异有可能被诱导，其中一些是用通用引物检测不到的。 此外，表观遗传机制可能影响TPE-OLD效应，包括启动子区域的DNA甲基化和组蛋白修饰( 12)这在实验上很难控制。 例如，在爱泼斯坦-巴尔病毒转化的淋巴母细胞中，永生化过程可能导致无法复制已建立的TPE-OLD效应。 在这些细胞中，端粒通过端粒酶和端粒交替延长而被拉长，这可能导致端粒功能失调，端粒结合蛋白减少( 63). 我们感兴趣的是 PPP2R2C型 在三个非常老的捐赠者的细胞中最为明显，进一步表明TPE-old的生理功能( PPP2R2C型 )在衰老的有机体中。
细胞特异性、冗余性和方法学上的挑战（例如，在没有人工细胞操作的情况下很难检测到这些细微的影响）可以解释为什么迄今为止还没有对人类细胞进行大规模的tpe报告。 其他组织和其他PP2A调节亚单位和其他TPE-OLD候选者必须检查，以揭示细胞特异性的影响。 为了更好地理解染色质结构如何影响TPE-OLD，还需要更多的结构实验。 这些实验包括将染色质相互作用图与表观基因组和转录组数据集相结合来研究基因表达的长期控制。 本文所述方法的另一个局限性是可能分别对复制性和非复制性老化物种进行了错误分配。 例如，关于鲸目动物的数据很少，蓝鲸、独角鲸和瓦基塔也可能复制衰老。 对于每一个新的TPE-OLD候选者，应进行验证性研究，以实验证实TPE-OLD效应，并排除基因同步性导致端粒位置的原因，例如，在进化过程中未被破坏的遗传位点的物理共域化。
总之，我们已经确定了一个众所周知的衰老保护机制（mTOR抑制）的生理触发因素（端粒磨损）。 短端粒和肿瘤抑制之间的这种机制性联系指向复制性衰老的肿瘤抑制功能。 我们发现了大量新的TPE-OLD候选基因，并且我们提出了一种启发式策略，可以很容易地识别候选的TPE-OLD基因。 TPE-OLD基因是干预癌症和衰老相关过程的潜在靶点。 当端粒变短时，它们的激活可能具有保护作用，但它们并不一定在所有情况下都有有益的作用，例如在与疾病相关的细胞状态下。
材料和方法 实验设计 利用Ensembl基因组数据库中的跨物种数据，在电子计算机上筛选出可能发生TPE-OLD的基因。 我们关注的是一组显示保留端粒距离且与细胞生长和衰老密切相关的基因。
进一步研究的目的是检测在细胞周期停止之前，在衰老但仍在复制（早期）细胞中端粒相关的基因表达和细胞生理学变化。 通过培养细胞直至细胞周期终止，并在最终停止前将冷冻样品从10～15pds解冻，建立了细胞的早期阶段（原代细胞高PDs）。
人类基因及其同源基因端粒距离的检索 我们从Ensembl Mart版本100（发布于2020年4月）的公共MySQL数据库中检索到基因端粒距离( 64). Ensembl Comparia确定的正射测井曲线被接受( 65)按“一个2个一个”、“一个2个多”或“多个”的定义。 如果某个物种是已建立的模式生物之一，则将其纳入分析( S . 酿酒 和 C . 挽歌 )或者如果其基因端粒的中间距离至少为7.5 Mb，即果蝇的中间距离，作为Ensembl基因组组装质量的阈值，以避免染色体片段末端出现假阳性。 为了便于解释，物种用它们的共同名称来表示。 散点图是用R( 66)版本4.0.1和ggplot2包； 热图是用gplots创建的( 67)从已知基因位置效应的基因家族中定制选择基因的软件包。 端粒在Ensembl中没有注释。 作为确定基因端粒距离的生物学锚定，我们选择了基因在最接近端粒的同一染色体臂上的位置，即每个染色体的第一个（p臂）或最后一个（q臂）编码序列。
端粒保留距离的测定及TPE-OLD候选物的筛选 对于每一个基因，我们确定了与端粒的距离是最大的，染色体位置之间允许的最大成对距离设置为1MB。 我们允许每个基因有两个1兆字节宽的区域。 这两个区域所覆盖的同源基因数目之和决定了该基因作为TPE-OLD候选基因的等级。 为 图1B无花果。 从S1到S3，我们用一个无参数的完全连锁树，用R函数hclust，我们提供了一个自定义的距离函数，然后使用例程“cutree”对正射原虫的染色体位置进行分组。 我们系统地重复了ENSEMBL104中所有人类基因，在所有完全测序的“复制老化”物种中至少有12个同源基因。
在散点图中 图2上的物种 十 轴心主要根据复制性衰老和“非复制性衰老”进行分类，其次是根据它们的基因端粒距离中位数进行排序。 散点图用一个独特的符号表示基因，并显示端粒的距离 是的 轴心国。 超过20 Mb的位置将在散点图中剪裁。
本手稿的所有R和shell脚本都可以在网上找到( 68)以便于更新即将发布的Ensembl或自定义基因选择。 如前所述，将一个物种归类为假定TL依赖的复制衰老（绿色标记）的标准是TL<20kb，端粒酶水平无法检测，并且没有停滞( 18).
基因集富集分析 基因富集分析由g:profiler进行，如中所述( 19). 简单地说，计算一个浓缩分数（ES），它反映了一个集合的程度 S 在整个排行榜的极端（顶部或底部）的代表性过高 我 统计显著性（名义上 P ES的值）是通过使用一种基于经验表型的排列测试程序来估计的，该程序保留了基因表达数据的复杂相关结构。 假阳性的比例是通过比较标准化ES的观测分布和零分布的尾部来计算假阳性率来控制的。
细胞和细胞培养系 人皮肤原代成纤维细胞系来源于Progeria研究基金会（PRF）细胞和组织库。 HGP细胞系为HGADFN003、HGADFN127、HGADFN164和HGADFN178。所有HGP细胞系均表现出典型的HGP突变[LMNA外显子11，杂合子c.1824C>T（p.Gly608Gly）][详细信息见( 69)]. 我们没有检测非经典或多重突变的细胞系（排除标准）。 突变分析柱状图由PRF细胞和组织库测序，可按要求提供。 健康的儿童控制皮肤成纤维细胞系（707731778和811）是来自明斯特儿童医院的礼物（Thorsten Marquardt教授）。 这些成纤维细胞来自儿童，他们的遗传疾病被排除在外，而且他们的症状也被发现是非遗传原因。 所有细胞系的培养物支原体污染检测均为阴性。 建立细胞系的伦理认可和儿童父母的知情同意。 来自成人供体（N14）的一个人类初级真皮成纤维细胞系是雷根斯堡大学E.Orso的礼物。 表S5总结了所有成纤维细胞系的特性。
所有人成纤维细胞保存在Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）高葡萄糖（4.5 g/L）中 我 -不含丙酮酸的谷氨酰胺（Gibco，目录号41965）补充10%胎牛血清（FBS；生物色素）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（生物色素，目录号A2212），以下简称“成纤维细胞培养基”。此外，我们分析了不同年龄健康人成纤维细胞供体的mRNA。
1301细胞系（来源于T淋巴细胞白血病）是S.Roura（西班牙巴塞罗那，德国Trias i Pujol研究所ICREC研究小组）的礼物。 所有其他LCL均来自BASE-II参与者。 我们分析了根据LCL的可用性选择的413名BASE-II参与者的分组。 BASE-II是一项前瞻性的多学科和多机构研究，旨在调查与柏林老龄化轨迹相关的因素( 43, 70). 所有受试者对柏林查理特大学伦理委员会批准的研究方案给予书面知情同意（伦理批准编号：EA2/029/09）。 来自BASE-II研究的1301细胞系和LCLs均保存在RPMI 1640培养基中 我 -谷氨酰胺（Gibco，目录号11875-093），添加10%FBS（生物色素）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（生物色素，目录号A2212）。 所有细胞在37℃下在含有5%CO的加湿培养箱中生长 2 .
HUVECs从PromoCell（目录号C-12200；批号：449Z004）获得，并使用同一公司的内皮细胞生长培养基试剂盒（目录号C-22110）进行培养。 向培养基中添加来自赛默飞世尔科技公司（目录号15140122）的青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）。 在37°C和5%CO的加湿培养箱中培养几代人脐静脉内皮细胞 2 .在T75细胞培养瓶（Sarstedt，目录号83.3911.302）中进行扩增、细胞培养和实验。 高细胞密度被选为随后的收获。
h 第三者 不朽 成纤维细胞被来自包装细胞系（PA317-TERT）的逆转录病毒上清液感染，该细胞系根据先前描述的方法克隆到pAbepuro载体中，稳定表达人类端粒酶( 47, 71). 载体和包装细胞系是W.Wright（美国德克萨斯州达拉斯市UTSW医学院）赠送的礼物。 根据既定方案用嘌呤霉素进行2周选择后( 47)用h测定法检测感染和选择 第三者 用实时PCR表达和TL的测定( 72).
测量用测试点 成纤维细胞系的测试点被分类为“低群体倍增（PD）的原代细胞”（PD 13到20）或“高PD的原代细胞”（PD 34到55）。 通过培养细胞直至细胞周期终止，并在最终停止前将冷冻样品从10～15pds解冻，建立了细胞的早期阶段（原代细胞高PDs）。 最近被永生化的细胞被分类为低PD（h后PD 14～34）的永生化细胞 第三者 永生化）和永生化后具有大量PDs的细胞被归类为高PD（h后PD为55～70）的永生化细胞 第三者 永生化）。 在PDs培养基中，成纤维细胞在衰老前大致相同的时间间隔内（对照组pD37和HGP-pD20中永生化的平均PD）。
过氧化氢处理 8个成纤维细胞系（HGADFN003、HGADFN127、HGADFN164、HGADFN178、707、731、778和881）的细胞在10 cm培养皿中生长至100%汇合。 对于H 2 O 2 处理后，每个细胞系的两个培养皿用200μmH处理2h 2 O 2 在10ml成纤维细胞培养基中； 另外三道菜加工相同，但没有H 2 O 2 培养2小时后，用5毫升PBS（Gibco，目录号14190250）清洗细胞，并在新鲜成纤维细胞培养基中再培养22小时。 随后，从一个H 2 O 2 从培养皿和一个未经处理的培养皿（作为对照）中提取8个细胞系的每个细胞系进行Western blot分析。 此外，H 2 O 2 -8个细胞系中的每一个细胞系的压力培养皿和另一个未经处理的培养皿被收集用于基因表达分析。 从第三个未经处理的培养皿中收集每个细胞系的细胞进行TL测量。
实时定量PCR 对于mRNA定量，使用标准提取试剂盒（Macherey-Nagel NuclearSpin RNA，目录号740955）分离总RNA，并用NanoDrop ND 1000分光光度计进行定量。 互补DNA（cDNA）的合成是按照制造商的说明书[M-MLV逆转录酶，RNase（H ?), Promega，目录号M5301]。 1微克的mRNA用于逆转录酶反应。
使用Applied Biosystems的TaqMan Universal Master Mix II，no.UNG（目录号4440040）并遵循制造商手册进行qPCR。 cDNA样品（5ng/μl）分三次测定； 将非模板对照（水）分两次在384井井中进行分析。 使用Bio-Rad CFX384实时C1000热循环仪进行分析，热循环曲线如下：95°C下10分钟，95°C下50次循环15 s，60°C下1分钟，并采集信号。 对于潜在TPE基因和对照基因的基因表达定量，使用了Applied Biosystems的基因表达TaqMan分析。 底漆特性见表S7。相对定量采用ΔΔCt法。 将每个基因的相对表达水平标准化为未经处理的低PD细胞的水平。 平均值和扫描电镜是根据技术复制品或三倍生物复制品计算的。
热释光测量 使用标准提取试剂盒（DNeasy血液和组织试剂盒，Qiagen，目录号69504）进行DNA提取。 如前所述，使用改进的MMqPCR方法测定平均TL( 73). 这项技术使端粒特异性和单拷贝基因（参考）扩增在一个单一的反应和量化测量在不同的温度。 端粒与单拷贝基因含量之比（TLR）作为TL的相对度量，以任意单位表示。 将DNA样品（20ng/μl，作为一个拷贝）和参考DNA标准品（186.6～0.09ng）分三份在不同的平板上进行测定。 将非模板对照（水）和阳性对照（人白血病细胞系1301dna）制备成两份，并在每个平板上运行。 使用Bio-Rad CFX384实时C1000热循环仪进行分析，热循环曲线如下：95°C下，循环15分钟； 94°C下15 s的2个循环； 49°C下15 s的1个循环； 在94°C下进行40次循环，15 s； 在62°C下循环10秒； 在72℃下进行1次循环15 s，在85℃下进行10 s，在89℃下进行15 s的信号采集。 在以下最终浓度下使用PCR试剂：使用提供的钛Taq PCR缓冲液（目录号639208），每次反应1 U钛Taq DNA聚合酶，0.75×SYBR绿I（Sigma-Aldrich），0.2 mM脱氧核苷酸三磷酸，1 mM二硫苏糖醇，1 M甜菜碱，每个端粒引物（telg和telc）900 nM， 每个单拷贝基因引物（albu和albd）为300nm。 底漆顺序如表S7所示。
所有样品测量一式三份，三次测量的平均值用于报告每个样品的平均TL。 所有样品的批内变异系数均<0.3。
SA-β-Gal染色 用4株HGP患者成纤维细胞系和2株对照细胞系（731和/或811）进行SA-β-Gal染色。 β-半乳糖苷酶活性的测定使用来自Sigma-Aldrich的组织化学染色试剂盒（目录号CS0030）。 程序是根据制造商的建议进行的。 简单地说，细胞被转移到一个12孔板的两个孔中，并在成纤维细胞培养基中培养大约1天（大约50-70%汇合）。 一个孔中的细胞用200μmH处理 2 O 2 在2ml成纤维细胞培养基中培养1.5小时，用1ml PBS洗涤，在成纤维细胞培养基中再培养4小时，然后染色。 未处理的细胞在没有H 2 O 2 .在染色程序中，首先用每孔1ml PBS洗涤细胞两次，然后用500μl 1×固定缓冲液[10×固定缓冲液（目录号F1797）稀释，在室温（RT）下固定6至7分钟 2 O] 一。 细胞培养皿中的最终浓度为2%甲醛、0.2%戊二醛、7.04mmNa 2 HPO公司 4 1.47毫米KH 2 人事军官 4 0.13 M NaCl和2.68 mM KCl。 继续染色程序，然后用1ml每孔PBS再次冲洗细胞三次，并在37°C下无CO培养过夜 2 500μl染色混合物[10×染色液（目录号S5818）、试剂B（目录号R5272）、试剂C（目录号R5147）、X-加仑溶液（目录号X3753）]。 染色混合物在使用前通过0.2-μm过滤器过滤，以去除聚集物。 在放大×50倍的光镜下，计数4个视野内的所有可见细胞，确定SA-β-Gal-阳性细胞的百分比。 计数是由两个不同的人独立进行的，他们对治疗是盲目的。 由于H后细胞完全死亡，4个盘子被排除在分析之外 2 O 2 治疗。 利用技术复制品和生物复制品形成平均值和标准差。
马克杯分析 用4株HGP患者成纤维细胞系和2株对照细胞系（731和/或811）进行MUG检测。 这种高灵敏度的分光光度法是SA-β-Gal染色和主观视觉定量的替代方法，可测量细胞裂解物中的酶活性( 69). 在本实验中，β-半乳糖苷酶作用于底物MUG，产生4-甲基伞形酮半乳糖苷酶，可通过荧光法检测( 74). 对于每个细胞系，大约3.2×10 6 细胞移入两个5cm培养皿中（约1.6×10） 6 每个培养皿的细胞数）并培养到50%到70%的汇合。 每个细胞系的一个培养皿用200μM H处理 2 O 2 在3ml成纤维细胞培养基中培养1.5小时，然后在正常成纤维细胞培养基中再培养4小时。 加里和金德尔根据协议执行了以下步骤( 75). 用1 ml PBS洗涤细胞6次，用200μl裂解缓冲液[5 mM CHAPS，40 mM柠檬酸和40 mM磷酸钠（pH 6）]溶解，并使用细胞刮刀转移到1.5 ml Eppendorf管中。 细胞旋转20s，12000离心 g 室温下5分钟。上清液在20°C下冷冻，直到分析。 为了进行测量，将100μl的裂解产物转移到反应管中，并与50μl的裂解缓冲液和150μl的2×反应缓冲液（40 mM柠檬酸、40 mM磷酸钠、300 mM NaCl、10 mM巯基乙醇和4 mM MgCl）混合 2 （pH 6），储存于4°C]； 1.7毫米马克杯（Sigma Aldrich，目录号M1633，储存于 ? 在使用前立即添加。 将反应溶液在37℃下培养3小时。 3小时后，提取50μl反应溶液并转移至含有500μl停止溶液（400 mM Na）的新Eppendorf管中 2 一氧化碳 三 )抑制酶反应。 然后，将150μl溶液转移到96孔板的孔中。 荧光在360 nm激发和465 nm发射下用Fluoroskan Ascent FL（Thermo Fisher Scientific）测量两份荧光。 以人血清白蛋白为标准，采用双辛酸（BCA）法测定蛋白浓度，并将荧光信号归一化为总蛋白浓度。 典型浓度为0.3至1.0μg/ml。 结果显示为每毫克的相对荧光单位（RFU/mg）。 根据生物复制品的技术复制品计算平均值和标准差。
免疫印迹法 成纤维细胞系在一个7厘米的培养皿中生长到融合处（~5×10 6 细胞）用5ml 0.1%EDTA/PBS洗涤，然后用400μl胰蛋白酶/EDTA分离（Gibco，目录号25200-056）。 在7 ml成纤维细胞培养基中取出细胞，并在1200下离心 g 在室温下5分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在1 ml PBS中，转移到1.5 ml Eppendorf管中，并在1200时再次离心 g 5分钟。上清液被丢弃， 将细胞重新悬浮在200μl蔗糖Hepes缓冲液中[SHC缓冲液；0.2 M蔗糖，0.02 M Hepes（pH 7.3）和完全不含EDTA的超片（罗氏，目录号：05 892 791 001）]中，通过26G胰岛素注射针在注射器中上下移动10次来溶解细胞悬浮液。 在6000下离心10秒后 g 为了去除未分析的细胞碎片，将上清液等分入Eppendorf试管中并储存在 ? 80°C，直到分析。
使用皮尔斯BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号23225）以白蛋白为标准，测量蛋白质浓度。 然后，将15μg细胞匀浆与2×样品缓冲液[0.1 M tris（pH 6.8）、8%（w/v）SDS、40%（w/v）甘油、溴酚蓝（0.2 mg/ml）和20%β-巯基乙醇]混合。 用7.5%和10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 将凝胶转移到聚偏氟乙烯薄膜（Millipore，目录号IPVH00010）。
用抗磷酸p70s6激酶（Thr）的一级抗体培养细胞膜 389 )（108D2）兔单克隆抗体（mAb）（细胞信号技术，目录号9234）（1:2000），磷酸化mTOR（Ser 2448 )（D9C2）XP兔单克隆抗体（细胞信号技术，目录号5536）（1:1000）和磷酸化Akt（Ser 473 )兔单克隆抗体（细胞信号技术，目录号9271）（1:1000），全部在牛血清白蛋白封闭溶液[5%牛血清白蛋白，0.1%吐温20，20 mM tris和0.15 M NaCl（pH 7.5）]中稀释，在4℃下过夜。 然后用山羊抗兔IgG（H+L）–辣根过氧化物酶（HRP）–结合（Bio-Rad，目录号1706515）（1:5000）二级抗体在RT下培养1小时。 用自制增强化学发光（ECL）溶液，在200 ml 0.1 M tris溶液（pH值8.6）中使用2 ml溶液a【50 mg鲁米诺（Fluka，目录号09253）】和0.2 ml溶液B【11 mg对香豆酸（Sigma-Aldrich，目录号501-98-4）的自制增强化学发光（ECL）溶液中暴露斑点 在10 ml二甲基亚砜（DMSO）]中添加1μl 30%H 2 O 2 每次使用前。 用甘氨酸剥离缓冲液（100 mM甘氨酸和320 mM HCl）在60°C下剥离30分钟。
用抗p70 S6激酶克隆20-10C-6兔单克隆抗体（Millipore，目录号05-781R）（1:6000）在4℃下孵育过夜； mTOR（7C10）兔单克隆抗体（细胞信号技术，目录号2983）（1:1000）； Akt（C-20）（圣克鲁斯生物技术公司，目录号sc-1618）（1:500）； 以及小鼠单克隆抗β-肌动蛋白（克隆AC-15，Sigma-Aldrich，目录号A5441）（1:80000），所有这些都在乳阻断液中稀释[5%脱脂奶粉，0.1%吐温20，20 mM tris和0.15 M NaCl（pH 7.5）]。 作为次级抗体，我们使用山羊抗鼠IgG（H+L）–HRP结合物（Bio-Rad，目录号1706516）、山羊抗兔IgG（H+L）–HRP结合物（Bio-Rad，目录号1706515）、兔抗山羊免疫球蛋白和多克隆HRP（Dackocytomation，目录号P0449），β-肌动蛋白的稀释度为1:40000，所有其他的稀释度为1:5000。 RT培养时间为1小时。如上所述制备印迹。
对于ARSA实验，使用人抗ARSA/ARSA抗体（研发系统，目录号MAB2485）（1:1000）在4°C下培养过夜，如上所述。 二级抗体山羊抗小鼠IgG（H+L）–HRP结合物（Bio-Rad，目录号1706516）（1:5000）培养1小时。 印迹暴露于超信号West Femto最大灵敏度基板（Thermo Fisher Scientific，目录号34089）上的CL-XPosure薄膜（Thermo Fisher Scientific，目录号34096）。 如上所述，剥离印迹并用单克隆抗β-肌动蛋白抗体孵育。
使用Image Studio Lite量化软件（LI-COR）进行密度分析。 从生物复制品和技术复制品中计算平均值和扫描电镜值，并将其标准化为β-肌动蛋白。
三维荧光原位杂交 三个HGP患者的成纤维细胞系（HGADFN127、HGADFN164和HGADFN178）和三个对照细胞系（707、731和778）被用于3D-FISH实验。 具有短端粒和长端粒的细胞对用于3D-FISH分析。 在T25烧瓶中培养成纤维细胞，直到它们达到100%融合。 然后对细胞进行胰蛋白酶消化和离心，并将细胞颗粒溶解在PBS中。
对于载玻片制备，细胞按照既定的直接细胞核制备方案进行处理。 简单地说，细胞悬浮液与0.9%氯化钠以1:1的比例混合。 在210℃离心10分钟后 g RT时，去除上清液，将细胞颗粒与5 ml 0.4%KCl溶液（预热至37°C）在RT下孵育10分钟，然后加入2mL的冷冻固定溶液（甲醇/乙酸3+1），再次离心整个混合物。
将颗粒细胞固定在5ml的冰固定液中。 首先，逐滴加入1ml固定液并仔细混合。 然后缓慢地添加其余的固定溶液，并再次小心地混合。 定影液立即更换了五次。 最后，抽吸上清液，再悬浮细胞颗粒。 固定后，将10μl细胞悬液小心滴入载玻片上，在80°C的加热板上培养15分钟，并用PBS短暂洗涤。 对于胃蛋白酶消化，将载玻片与胃蛋白酶溶液[50μl胃蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号1.07192.001）和100 ml 0.01 N HCl]在37°C下培养10分钟。 用PBS洗涤载玻片，然后用PBS/MgCl孵育3分钟 2 .然后将载玻片与1%甲醛一起孵育10分钟，然后在室温下用PBS孵育3分钟，然后在室温下用升华乙醇（70–85–100%）孵育2分钟； 最后，在室温下干燥载玻片。
杂交时，在杂交区加入2μl探针。 Vysis TelVysion 4p光谱探针（雅培，Vysis，目录号30-252004）用于检测4p子午线区域。 用于检测 PPP2R2C型 在染色体上，用光谱橙标记RP11-462B2-BAC（Illumina）。 然后用盖玻片小心地覆盖玻片，并用Fix-O-Gum密封（Marabu，目录号29010017000）。 在80°C的加热板上进行共纯化步骤5分钟。 然后将载玻片置于37°C避光水浴中培养24小时。 在最后的洗涤步骤中，小心地取下玻璃盖，将载玻片在73°C的0.4×SSC/0.3%IGEPAL?CA-630（Sigma-Aldrich，目录号13021）溶液中培养2分钟，用2×SSC/0.1%IGEPAL溶液短暂洗涤，然后在室温下用PBS洗涤。重复上述乙醇系列， 玻片是风干的。 将一滴Vectashield/4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）混合物（Vectashield，Vector，#H-1000；DAPI，Sigma-Aldrich，目录号10236276001）用吸管吸到载玻片上，并用盖玻片盖住。
图像通过共焦扫描激光显微镜（蔡司LSM 880 AxioExaminer Z1）获得，DAPI使用405 nm激发/415-480 nm发射，光谱绿488 nm激发/500-545 nm发射，光谱橙色561 nm激发/565-640 nm发射。 采用63×数值孔径1.4平面无色差油浸物镜，以0.3mm的间隔拍摄光学截面，将针孔设置为约1个airy单元，以获得厚度相同的所有波长的光学切片。 然后使用imaris9.3软件（和或位平面）处理图像。 每次实验共分析70个细胞核（140个距离）。 少于或多于四个信号（两个红色和两个绿色信号）、不规则的DAPI染色（例如有丝分裂细胞）和异常细胞形状的细胞被排除在进一步的分析之外（排除的数据点可根据要求提供）。 它们的重心之间的距离（每个目标中最近的探针之间的距离）通过三维重建和表面绘制来确定，并用于进一步的统计分析。
二进制和序数数据显示为绝对数和百分比。 连续变量在正态分布时显示为平均值（SD），非正态分布时显示为中值（范围）。 由于三维重建后的核内重力中心之间的距离不是正态分布，因此采用了两种距离（AB和CD）的对数变换。 用层次线性模型估计永生化对重心距离的影响。 我们允许细胞间随机变异，细胞被嵌套在细胞系中。 结果与他们的 P 值和95%置信区间（表S6）。 将距离分为十分位数（0.7258、1.090、1.3442、1.606、1.93、2.28、2.773、3.49和4.451μm），以进行图形显示（图S8、C和D以及S9）。 评价细胞永生化与否的最佳分割点( 图4以及图S8，A和B），R包“最佳切入点”( 76)被利用了。 最佳切割点为2.26μm。 曲线下面积为0.63，敏感性为52%，特异性为69%。
PPP2R2C型 通过27 mer siRNA双链击倒 击倒 PPP2R2C型 使用Trilencer-27人siRNA试剂盒（OriGene；SR303688）进行。 所提供的siRNAs混合使用以最大限度地提高敲除效率。 细胞在含有10%FBS（生物色素）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）（生物色素，目录号A2212）的DMEM中在T25烧瓶中生长。
本实验以HGADFN127细胞系的原代细胞为实验材料。
当细胞达到大约80%的汇合时，按照制造商提供的说明，将siRNAs添加到25或50nm的培养基中。 当细胞开始出现细胞应激迹象时（7小时），用正常培养基代替含siRNA的培养基。 在去除含有siRNA的培养基72小时后收获细胞，并按上述方法裂解蛋白质和mRNA。
血清缺乏 对于血清剥夺实验，811初级和 赫特 使用永生细胞系。 细胞在两个T75烧瓶中生长，在不含丙酮酸、添加10%FBS和青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM中处理18小时，在添加10%FBS的DMEM中处理17小时，然后在PBS中仅处理1小时。 如前所述，收集细胞进行蛋白质和RNA分离。 cDNA样品（5ng/μl）分三次测定； 将非模板对照（水）分两次在384井井中进行分析。 对于基因表达定量，使用以下TaqMan分析： PPP2R2C型 （应用生物系统公司，目录号Hs00902099 U m1）和 mTOR公司 （应用生物系统公司，目录号Hs00234508 U m1）。 人类 PPIA公司 ( 亲环蛋白 )（Applied Biosystems，目录号4333763F）被用作内源性对照。 采用ΔΔCt法进行相对定量。
抑制剂试验 三个来自健康人的成纤维细胞系（707、731和778）被用于TSA/5-AzaC和RSV实验。 TSA抑制组蛋白脱乙酰基酶( 33). 5-AzaC导致非特异性整体DNA去甲基化( 34)RSV诱导端粒DNA不稳定( 35).
对于TSA和5-AzaC处理，细胞生长在4个100 mm×20 mm的组织培养皿中（Falcon，目录号353003），用字母A到D表示，从25%初始汇合到70%最终汇合（A到D；A:DMSO对照，B:TSA仅；C:5-AzaC；D:TSA和5-AzaC）。 将溶解在全培养基中的5-氮杂酸（1μg/ml；Sigma-Aldrich，目录号A2385）添加到培养皿C和D中。然后在5%的CO中培养细胞 2 37°C下48小时。 培养48小时后，将溶解于二甲基亚砜中的TSA（0.2μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号T8552）添加到培养皿B和D中。为了控制非特异性二甲基亚砜副作用并创造可比条件，此时将二甲基亚砜添加到培养皿A和C中。 培养24小时后，废弃旧培养基，加入新鲜培养基。 在另外24小时的平衡培养后，分离mRNA，并按所述进行qPCR。
对于RSV治疗，细胞在6孔组织培养板（Falcon，目录号353046）的四个孔（A、B、C和D）中生长，并在5%的CO中培养 2 在37°C下保持24小时。 在新鲜培养基中加入不同浓度的二甲基亚砜中的RSV（默克，目录号554325）：A:0μM RSV（仅DMSO对照）； B： 0.25μM RSV； C： 1.0μM RSV； D:10μM RSV。 培养48小时后，分离mRNA，进行qPCR。
健康细胞系778用于SIRT6抑制剂治疗。 化合物BCI-150是新近开发的SIRT抑制剂，对SIRT6和SIRT1和SIRT2具有选择性( 38). 细胞在6孔组织培养板的两个孔（A和B）中生长，并在5%的CO中培养 2 在37°C下保持24小时。 随后，将浓度为50μM（二甲基亚砜）的SIRT6抑制剂BCI-150（Asiner有限公司，目录号SYN 17739303），从a.Del Rio（意大利博洛尼亚国家委员会有机合成与光活性研究所）处添加到B井中，浓度为50μM（二甲基亚砜）。 A井（对照组）中仅添加二甲基亚砜。 细胞再培养48小时； 如上所述分离mRNA，并进行qPCR。
根据制造商手册，使用Applied Biosystems公司的TaqMan Universal Master Mix II，no UNG（目录号4440040）进行qPCR。 cDNA样品（5ng/μl）分三次测定； 将非模板对照（水）分两次在384井井中进行分析。 使用Bio-Rad CFX384实时C1000热循环仪进行分析，热循环曲线如下：95°C下10分钟，95°C下50次循环15 s，60°C下1分钟，并采集信号。 对潜在TPE基因的基因表达进行定量分析 PPP2R2C型 ，采用TaqMan分析法（Applied Biosystems，目录号Hs00902099 U m1）。 人类 PPIA公司 ( 亲环蛋白 )（Applied Biosystems，目录号4333763F）被用作内源性对照。 采用ΔΔCt法进行相对定量。 将每个基因的相对表达水平标准化为DMSO处理的最年轻细胞（低PD）。
细胞在生长期的分布 成纤维细胞通过20 mm组织培养皿（Falcon，目录号：353003）在100 mm上培养至约70%至80%的汇合点。 细胞同步化用DMEM/1%青霉素/链霉素和0.1%胎牛血清培养24小时。 24小时后，收集细胞并准备进行细胞周期分析。 将细胞颗粒重新悬浮在500μl 70%乙醇中，并在4℃下培养24小时。 将细胞离心并用碘化丙二钠（50μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号25535-16-4）和核糖核酸酶A（25μl/ml）（Macherey-Nagel，目录号740505.50）重新悬浮于200μl PBS中，然后在室温下黑暗中培养30分钟。 将细胞悬浮液添加到荧光激活细胞分选（FACS）Falcon中，并填充200μl PBS。 对一万个细胞进行常规FACS分析（FACSCalibur）。
芳基硫酸酯酶活性 芳基硫酸酯酶是蛋白质匀浆中的一种酶活性，根据B?hringer的修改方案进行测定 等 . ( 77). 为此，分离出25μg总蛋白，如( 78)在50μl SHC缓冲液和50μl反应缓冲液中稀释[10 mM 4-硝基邻苯二甲酸钠、10%（w/v）NaCl、0.3%（v/v）Triton X-100（Sigma-Aldrich）和牛血清白蛋白（1 mg/ml；Sigma-Aldrich）]，加入0.5 M乙酸钠（pH 5.0），然后在37°C下培养6小时。 通过添加800μl停止缓冲液（1 M NaOH）终止反应，并使用分光光度计（Pharmacia Biotech）在515 nm处测定ARSA释放的4-硝基邻苯二酚。 作为空白，立即用250μl 0.5 N NaOH停止类似试验，并再次读取吸收读数。 反应后与空白分析的吸收率之间的差异转化为每分钟降解的pmol硝基邻苯二酚硫酸盐的活性单位。
其他统计分析 R 3.6.1中的包装优化要点( 79)用于所有散点图和3D-FISH切点分析。 散点图和热图的数据检索代码在 https://bitbucket.org/ibima/tpe-old并用r3.6.1编程( 79). 统计分析使用OriginPro 2018和SPSS for Windows（IBM Corp.发布于2017年。IBM SPSS Statistics for Windows，版本25.0。Armonk，NY:IBM Corp.）进行统计分析。 正态分布变量显示为平均值±标准差或如图所示的SEM。 双面精确曼惠特尼 美国 检验用于评估两个独立组在非正态分布变量上的差异。 P <0.05被认为具有统计学意义。
