钴胺核糖开关对柯林类辅助因子广泛敏感，实现有效的基因调控策略

一些细菌的mrna包含一个叫做核糖体开关的区域，它通过与细胞中的代谢物结合来控制基因的表达。通常，通常情况下，核糖体开关感知和响应有限范围的细胞代谢物，通常只有一种类型。

　　

摘要

在细菌中，许多重要的代谢过程是由核糖开关控制的，这种核糖开关是直接结合和检测代谢物的基因调控核糖核酸。高度特异的效应器结合使核糖开关能够对单一的生物相关代谢物作出反应。钴胺素核糖开关是一个潜在的例外，因为自然界中存在十几种化学相似但功能不同的钴胺素变体（corrinoid辅因子）。在这里，我们测量了钴胺素核糖开关的活性体内使用枯草芽孢杆菌荧光报告系统发现，在38个被测的核糖开关中，有一个亚群对类胡萝卜素的反应不一致，而其他的则是半选择性的。对嵌合核糖开关和结构模型的分析表明，与其他核糖开关类不同，钴胺素核糖开关通过感知其结构构象的差异来间接区分类胡萝卜素。这一调控策略使核糖开关的特异性与细胞内的corrinoid需求一致B、 枯草模型。因此，细菌可以利用广泛敏感的核糖开关来处理重要代谢物的化学多样性。

重要性一些细菌的mrna含有一个称为核糖开关的区域，它通过与细胞中的代谢物结合来控制基因的表达。通常，核糖开关对有限范围的细胞代谢物进行感应和反应，通常只有一种类型。在这项研究中，我们发现了钴胺素（维生素B₁₂)核糖开关类是一个例外，能够感知和响应B的多种变体₁₂-统称为科林尼。我们发现钴胺素核糖开关的特异性不同，一些核糖开关对我们所测试的每一个类胡萝卜素都有反应，而其他一些则只对一个类胡萝卜素有反应。我们的研究结果表明，后一类核糖开关能够感知类胡萝卜素之间内在的构象差异，从而支持细胞对类胡萝卜素的特殊需求。这些发现提供了深入了解细菌如何感知和响应一组异常多样的，通常是必不可少的一组酶辅因子。

简介

控制基因表达是细胞以多种方式完成的一项基本任务。非编码rna是基因调控的一种手段，与历史上研究较多的基于蛋白质的机制并行或协同作用(1).在细菌和古细菌中，核糖开关是一种广泛存在的基因调控RNA，具有通过直接结合感受特定细胞内代谢物的独特能力(2).这些rna通常位于mRNA转录物的5′-非翻译区，在其转录物中作为下游基因的顺式调节器发挥作用。核糖开关由一个效应器结合适体结构域和一个表达平台组成。适配子结构域采用三维结构，可与同源效应分子结合。表达平台域是一个调节开关，它解释上游适体的效应器结合状态，通常促进或破坏下游基因的转录或翻译(三).核糖开关效应器和调控机制的多样性揭示了细菌如何感知和响应动态环境的基本见解，也推动了人类精确控制和操纵微生物的新方法(4–7).

钴胺素（Cbl）核糖开关（也称为“B₁₂“核糖开关”或“腺苷钴胺核糖开关”）是细菌中分布最广、结构最多样的核糖开关(8).它们直接结合各种形式的辅因子Cbl作为同源效应物(图1A和C) (9)调控参与Cbl生物合成、运输和使用的基因。Cbl依赖的酶在常见的代谢途径中发挥作用，包括蛋氨酸合成、脱氧核糖核酸合成、tRNA修饰以及某些氨基酸、脂肪酸和生物聚合物的降解(10–23).Cbl在抗生素合成、汞甲基化、类固醇分解代谢等较少见的代谢过程中也是必需的(24–37).比较基因组研究表明，大多数细菌进行Cbl依赖的代谢，Cbl核糖开关经常调节这些过程(8,38,39).然而，在大多数核糖开关研究中，一个被忽视的方面是，Cbl只是一类被称为corrinoids的酶辅因子的一员(图1B) (40).事实上，细菌中依赖于Cbl的酶通常与除Cbl以外的类胡萝卜素一起作用。然而，目前尚不清楚的是，这些天然存在的类胡萝卜素辅因子是否也是Cbl核糖开关效应器(41–47).

图1

图1本研究检测了主要的类胡萝卜素和核糖开关。（A） 钴胺素的化学结构，也叫维生素B₁₂灰色实线描绘了corrinoid尾部区域，在灰色虚线框中包含可变的下配体组。R基是上配体。（B） 名称，低配位体结构，以及本研究中使用的类胡萝卜素的缩写。Cbl、pCbl和CreCba是“完全的cornioid”（cobamides）。Cbi是一种“不完全的类胡萝卜素”，缺乏磷酸核糖基和较低配体基团，如图A中的括弧和波浪线所示。（C）Cbl核糖开关上游的二级结构模型B、 枯草 btuF公司基对茎（P）、环（L）和连接（J）都有标记。P6辅区在Cbl核糖开关序列中的长度和茎数高度可变，通常包含六个成对区域。在本例中，P6附件仅由两个成对区域组成。接吻环相互作用（KL，虚线）发生在适体的L5和表达平台的L13之间。M1表示突变C107U和C108U，在图2F（D）本研究检测了七种具有代表性的Cbl核糖开关的二级结构比对。“2°str”行表示成对碱基作为圆括号，连接表示句点，吻环碱基对用括号表示。以下生物和基因中的核糖开关给出了PDB编号或缩写：4GMA，腾冲热厌氧细菌；S、 在,嗜热共生菌 CBL公司;B、 sub公司,B、 枯草 btuF；P、 梅格,巨蟹座;D、 哈夫,哈夫尼恩斯脱硫杆菌DSY0087；S、 卵子,卵孢子虫 btuB2型;五、 面值,小维管菌 木塔P13和起始密码子之间的不一致序列用核苷酸序列长度（nt）表示，但为了清楚起见，省略了实际的序列。

Corrinoid辅因子包含一个具有中心钴离子的高度取代的corrin环，一个与钴的β轴面协调的可变“上配体”部分，以及一个从corrin环延伸并终止于可变的“下配体”部分的尾部结构，该部分通常与钴的α轴面相协调(图1A和B).Cbl核糖开关对Cbl上部配体变体选择性的分子基础已经得到了较为深入的研究，但对corrinoid-tail变体的选择性仍大部分未被探索(9,48,49).据我们所知，只有一项研究直接检测了单个Cbl核糖开关的corrinoid tail特异性。体外结合力测定显示了大肠杆菌 btuB公司Cbl核糖开关结合完整的类胡萝卜素Cbl和2-甲基腺嘌呤酰钴酰胺（[2-MeAde]Cba），亲和力相差3.2倍(K_D=89和290?纳米）。此外，cobinamide（Cbi）是一种尾部截短的不完全类胡萝卜素，与适体结合的亲和力比Cbl低约8000倍(K_D=753个?μM），表明这种适体以选择性的方式结合了类胡萝卜素(50).根据先前对类胡萝卜素的代谢和Cbl核糖开关的研究，我们假设Cbl核糖开关具有一系列不同的类胡萝卜素尾特异性活性。

在这里，我们研究了来自12种细菌的38个Cbl核糖开关是如何对4种corrinoid的不同尾部结构作出反应的：Cbl、pCbl和CreCba，分别代表苯并咪唑基、嘌呤基和酚酰钴酰胺，以及Cbi，一种不完整的类胡萝卜素(图1B).为了比较几十个Cbl核糖开关的活性，我们在年设计了一个活细胞荧光报告系统枯草芽孢杆菌.与传统的体外生化方法，这个核糖开关报告系统捕捉完整的corrinoid反应基因调控过程，并提供多个并行效应器的快速功能测量。我们从报告系统的实验中获得的结果，以及对Cbl核糖开关和corrinoid效应器的比较结构分析，使我们能够建立一个机械模型来解释如何实现corrinoid尾部特异的基因调控。此外，我们研究了一种基因调控策略，以确定Cbl核糖开关的特异性，并讨论了这些发现的概念和实际意义。