通过胆固醇与CRAC基序的直接结合来调控PD-L1

　　

摘要

胆固醇是细胞结构、功能和生存能力的重要分子，在癌细胞的发育、发展和生存中起着至关重要的作用。早期的研究表明，降胆固醇药物可以抑制程序性死亡配体1（PD-L1）的高表达，这种高表达有助于肿瘤细胞的免疫逃避。然而，胆固醇对细胞表面PD-L1丰度的调控机制仍存在争议。在这里，我们利用核磁共振和生化技术证明胆固醇可以通过两个胆固醇识别氨基酸共识（CRAC）基序直接与PD-L1的跨膜结构域结合，形成三明治状结构，并稳定PD-L1以防止下游降解。关键结合位点的突变抑制了PD-L1-胆固醇相互作用，降低了PD-L1的细胞丰度。我们的研究结果揭示了一种独特的调节机制，可以控制PD-L1在癌细胞中的稳定性，为克服PD-L1介导的癌症免疫逃避提供了另一种方法。

简介

胆固醇是质膜的主要成分，影响细胞膜的结构完整性、厚度、通透性和流动性(1,2).作为几种激素的前体，胆固醇是调节细胞功能和信号传递的关键因素(三).胆固醇可以通过影响许多跨膜蛋白的结构、功能和动力学来调节细胞功能(4,5).例如，胆固醇增强电压依赖性阴离子通道（VDACs）的结构完整性和激活，并影响VDACs与其他蛋白质的相互作用(6).此外，胆固醇可维持G蛋白偶联受体（GPCR）的稳定性或改变其功能(7–10)例如，胆固醇耗竭通过阻碍配体结合来阻断趋化因子受体CXCR4的信号传导(11,12).胆固醇可以直接（通过胆固醇与蛋白质结合）、间接（通过膜特性的改变）或通过直接和间接机制的结合来调节这些膜包埋蛋白质的功能(5,9).在跨膜蛋白中发现了三个促进胆固醇敏感功能的主要胆固醇结合基序，包括胆固醇识别氨基酸共有基序（CRAC，L/V-X）_1–5个–Y/F–X_1–5个–K/R）(13,14)，一个倒置的胆固醇识别基序（CARC，K/R–X_1–5个–Y/F–X_1–5个–L/V）(15)以及胆固醇共识的主题(16).

最近，新的证据表明胆固醇在癌细胞中起着重要作用(17).癌细胞的快速增殖和侵袭需要高水平的胆固醇(18).一些临床和实验研究表明，胆固醇在癌细胞中的积累会增加某些癌症的发病率(19)他汀类药物是降低胆固醇的主要药物之一，对许多不同类型的癌症都有有益的效果(20).此外，肿瘤微环境中高胆固醇水平会影响肿瘤浸润免疫细胞的表型和活性(21,22)尽管胆固醇对免疫细胞的影响仍有争议。因此，调节胆固醇水平被认为是治疗癌症和提高免疫治疗效果的一种有前途的策略。

程序性死亡配体-1（PD-L1），一种在癌细胞质膜上高表达的蛋白质(23)在他汀类药物治疗后，表达明显降低(20)提示PD-L1与胆固醇之间有密切关系。两个典型的CRAC基序（图S1）存在于PD-L1的跨膜结构域（TMD）中，表明胆固醇具有很强的直接结合潜力。然而，与胆固醇的相互作用是否会影响PD-L1的稳定性或功能尚未确定。为了验证这一可能性，我们研究了胆固醇对PD-L1的影响。首先，生化分析表明胆固醇提高了PD-L1的稳定性，利用核磁共振（NMR）波谱，我们发现胆固醇可以直接与PD-L1的TMD中的两个CRAC基序结合。分子动力学（MD）模拟是一种强有力的补充方法，揭示了PD-L1与胆固醇相互作用的详细结构和能量信息。功能突变进一步证实了CRAC基序在介导PD-L1的细胞丰度中起关键作用。我们的研究结果为PD-L1与胆固醇的相互作用及其对肿瘤治疗的影响提供了分子水平的见解。

结果

胆固醇维持PD-L1的稳定性

为了研究胆固醇与PD-L1的关系，我们首先通过免疫荧光染色和共定位分析探讨了人结肠癌细胞系RKO细胞中PD-L1与胆固醇的空间关系，发现PD-L1和胆固醇与ImageJ确定的Pearson相关系数为0.83有很强的相关性（图S2，a和B）(24).蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理RKO细胞时(25)当加入胆固醇时，PD-L1的周转速度较慢（图S2、C和D）。接下来，我们检测了胆固醇、甲基β-环糊精（MCD）或辛伐他汀处理的RKO细胞中内源性PD-L1的表达。MCD是一种水溶性聚合物，可以消耗细胞中的胆固醇(26)辛伐他汀是美国食品和药物管理局批准用于降低总胆固醇的药物(27).westernblot分析表明，向RKO细胞中添加胆固醇，可以增加质膜中胆固醇的含量，上调PD-L1水平(图1A)而添加MCD或辛伐他汀可显著降低PD-L1的细胞丰度(图1、B和C).流式细胞术进一步证实了胆固醇、MCD和辛伐他汀对PD-L1细胞表面表达的影响(图1D)共焦成像(图1E).始终如一地，在胆固醇治疗后，PD-L1的细胞表面水平略有增加，但在通过MCD或辛伐他汀治疗去除胆固醇后，PD-L1的细胞表面水平显著降低。此外，添加MCD或辛伐他汀后，内源性PD-L1的泛素化显著增加（图S2、E和F）。总之，这些结果表明细胞胆固醇在PD-L1的定位和稳定性中起着关键作用。

图1胆固醇维持PD-L1的稳定性。

(A到C)用不同浓度的胆固醇（CHOL，0-50μM持续12小时）、MCD（0-7.5 mM持续6小时）或辛伐他汀（0-10μM持续12小时）处理RKO细胞。Western blot检测PD-L1在每个治疗中的表达（top）。PD-L1表达强度（相对于GAPDH）用ImageJ（底部）定量。所示数据为平均值±标准差(n=3）。P数值是用未配对的双面学生的t测试。(D和E)用流式细胞仪分析CHOL（25μM，12小时）、MCD（5 mM，6小时）或辛伐他汀（10μM，12小时）处理后细胞表面PD-L1的表达。用FlowJo（E）定量测定PD-L1水平。表达式数据显示为相对于对照组的折叠变化值，并表示平均值±标准差(n=3）。P数值采用单因素方差分析计算。(F和G)免疫荧光染色显示，经CHOL（25μM持续12小时）、MCD（5 mM持续6小时）或辛伐他汀（10μM持续12小时）处理的RKO细胞中存在PD-L1。用抗PD-L1抗体（绿色）标记PD-L1，用DAPI（蓝色）（F）染色细胞核。比例尺，10μm。荧光强度定量（G）；n=26、27、11和21，分别用于对照组、胆固醇组、辛伐他汀组和MCD组。用单因素方差分析确定统计学差异。所有结果都代表了三个独立的实验。

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我们进一步用K562细胞（人类永生化髓性白血病细胞系）验证了胆固醇对PD-L1表达的影响。在K562细胞中，加入细胞因子IFN-γ（IFN-γ）后，PD-L1表达上调(28).通过MCD或辛伐他汀降低K562细胞中的胆固醇水平在IFN-γ存在下下调PD-L1（图S3A）。用自然杀伤细胞（NK）来源的上清液处理K562细胞也显示出相似的结果；在NK细胞上清液存在的情况下，对MCD或辛伐他汀治疗的PD-L1水平降低了约70%（图S3B）。在另一个实验中，我们用IFN-γ对K562细胞进行预处理，并用抗PD-L1抗体标记细胞表面PD-L1。去除IFN-γ后，PD-L1水平下降了近50%，但在胆固醇存在下PD-L1的高表达（图S3，C到E）。总之，体外实验结果表明，改变胆固醇含量特别调节PD-L1的细胞丰度。

PD-L1-TC的核磁共振表征

以上结果表明胆固醇在控制PD-L1水平中起着重要作用。PD-L1的TMD中胆固醇识别基序（L255）-X-F257-XX-R260（CRAC1）和（L255）-XXX-F259-XX-R262（CRAC2）（图S1）的存在表明胆固醇有能力直接与PD-L1相互作用并提高蛋白质稳定性，正如其他受体所报道的那样。为了探索这种可能性，我们首先用溶液核磁共振波谱分析了人PD-L1与胆固醇之间的相互作用。PD-L1的跨膜/细胞质结构域（PD-L1-TC；氨基酸残基232至290）按照先前公布的方案进行表达和纯化（图S4、a和B）(29).纯化的PD-L1-TC在两性离子1,2-二甲基糠酰中重组-序号-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）/1,2-二己基-序号-甘油-3-磷酸胆碱（DH⁶PC）双核（DMPC摩尔比：DH⁶个人电脑，问=0.5）（图S4、C和D）。脊梁(图2A)通过一套基于横向弛豫优化光谱（TROSY）的标准三重共振实验确定了PD-L1-TC的侧链（图S5A）共振分配(30).PD-L1-TC的二级结构是通过使用TALOS+程序分析主链化学位移得到的（图S5B）(31).最后的合奏(图2B)在15个最低能量结构中[蛋白质数据库（PDB）：7DCV]是使用240个蛋白质核超滤效应（NOE）衍生的距离约束（图S5C）和38个氢键约束（表S1）计算得出的，主链原子和重原子的均方根偏差（RMSD）分别为0.619和1.194?。残基238～261形成了PD-L1-TC的螺旋区，其长度为38.6?(图2B).PD-L1的细胞质结构域很大程度上是动态的，因为没有具有二级结构特征的NOE信号（图S5C）。

图2双核中PD-L1-TC的NMR表征。

(A)二维¹H，¹⁵DMPC/DH中PD-L1-TC样品的N-TROSY-HSQC谱⁶用bruker600mhz光谱仪记录310k下的PC双核。百万分之几。(B)DMPC/DH中PD-L1-TC的15种最低能量结构的动画表现⁶PC双管。计算出的螺旋区域包含长度为38.6？的238到261个氨基酸（蓝色），被UniProt（右）预测的跨膜区域（氨基酸239到259，绿色）覆盖。(C和D)PD-L1-TC在DMPC/DH中膜浸没深度的测定⁶采用水溶性探针Gd-DOTA。¹H，¹⁵PD-L1-TC样品在缺少（红色）和存在（黑色）15mm Gd-DOTA时的N-TROSY核磁共振谱；这两种光谱都是在310k下用bruker600mhz光谱仪（C）获得的。前期效果(我/我₀)绘制了不同浓度Gd-DOTA（D）时N236和L248与[Gd-DOTA]的关系。我，在Gd-DOTA存在下的峰值强度；我₀，无Gd-DOTA时的峰值强度。(E)DMPC/DH中PD-L1-TC的评价⁶亲水性Gd-DOTA和亲脂性16-DSA顺磁探针的前效应。16-DSA（2mm）和Gd-DOTA（15mm）引起的峰值强度降低分别以橙色和绿色条形图显示。在DMPC/DH中对PD-L1-TC进行了测量⁶在一个¹H频率为700 MHz（pH 6.5）和310 K(F)由预作用确定的PD-L1-TC的膜分配。PD-L1-TC结构的位置沿脂质双层膜的轴方向显示。跨膜区（氨基酸239至261）以灰色突出显示，膜旁区（氨基酸262至272）以浅蓝色突出显示，细胞质区域（氨基酸273至290）以粉红色突出显示，残基236、251和261分别为绿色、红色和紫色。从Gd-DOTA滴定完整的前置放大图显示在右边。

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进一步用顺磁弛豫增强滴定法（PRE）评价包埋PD-L1-TC膜的构象(32).水溶性顺磁探针钆（III）1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（Gd-DOTA）和亲脂性顺磁性探针16-羟基硬脂酸（16-DSA）分别在DMPC/DH中滴定到PD-L1-TC⁶PC双管。记录了一系列二维（2D）TROSY-异核单量子相干（HSQC）光谱来确定预效应(图2C).随着Gd-DOTA浓度的增加，水相中残余物（如N236）的强度明显降低，而埋藏在脂质双层（如L248）中的残余物强度下降的速度慢得多(图2D).这些结果与亲脂性16-DSA的补充前滴定一致(图2E)表明膜包埋残基为T239-L261，膜中心位于L251附近(图2F).

胆固醇与PD-L1-TC中CRAC基序结合

接下来，我们在DMPC/DH中将胆固醇滴定为PD-L1-TC⁶通过二维TROSY-HSQC实验监测胆固醇引起的化学位移变化。在胆固醇浓度为0到2.5毫米的范围内记录核磁共振波谱。钯-L1-TC的胆固醇滴定导致核磁共振位置对一部分峰的实质性扰动(图3A).PD-L1-TC共振主要位于CRAC基序区，即F257、F259、R260和R262(图3、B和C).为了更精确地确定胆固醇结合位点，两种自旋标记的胆固醇衍生物，3β-DOXYL-5α-胆甾烷（DOXYL-CH）和25-DOXYL胆固醇（CNO）(33)，用于测定PD-L1-TC的前效应(图3D).DOXYL-CH在3β位置有一个氮氧化物部分，而CNO在靠近末端甲基的位置25有一个氮氧化物。分别用自旋标记的DOXYL-CH和CNO分别滴定到PD-L1-TC样品中，用一系列2D-TROSY-HSQC光谱检测单个残基的强度变化(图3E).DOXYL-CH诱导R260-R262残基产生强烈的PREs，表明胆固醇头部位于C端的膜旁区，而CNO则显著降低了G252-A254附近残基的强度(图3F)表明胆固醇尾结合在膜的中心。表观离解常数(K_d)利用预滴定数据进一步确定的值在0.32～0.44mm范围内，实验结合曲线与模拟曲线吻合较好n=2个(图3G) (34)这表明两个PD-L1结合位点在胆固醇结合方面具有正的协同作用。总的来说，前期数据表明胆固醇结合在从G252到R262的CRAC基序区域，因此头基群与细胞质室相关，酰基尾靠近膜中心。

图3PD-L1-TC中胆固醇结合位点的特征。

(A)叠加2D¹H，¹⁵0.2 mM N-TROSY-HSQC光谱¹⁵N-标记PD-L1-TC在700mhz下获得(¹在0毫米（红色）、0.5毫米（橙色）、1.0毫米（绿色）、1.5毫米（蓝色）、2.0毫米（紫色）或2.5毫米（黑色）胆固醇存在时，频率为310 K。(B)（A）图中四个区域的放大图，显示了两个CRAC基序（CRAC1:F257和R260；CRAC2:F259和R262）胆固醇滴定的特定化学位移扰动（右）。(C)DMPC/DH中添加1.5mm胆固醇后PD-L1-TC的NMR化学位移变化⁶PC双管。该图显示了PD-L1-TC在有或无胆固醇的情况下光谱之间的化学位移变化。(D)CNO（左）和DOXYL-CH（右）的化学结构显示在最上面的面板上。(E)前(我/我₀)不同硝基标记胆固醇（DOXYL-CH和CNO）对DMPC/DH中PD-L1-TC的影响⁶PC双管。比增宽¹H-¹⁵中间和底部面板分别显示了2.4 mM CNO和DOXYL-CH的氮相关峰以及添加抗坏血酸后加宽峰的强度恢复。(F)前(我/我₀)CNO和DOXYL-CH的分析。添加2.4mm的CNO在L252～A254之间表现出明显的预效应，而添加2.4mm的DOXYL-CH对R260～R262的预效应最为显著。我，在顺磁性剂存在下的峰值强度；我₀，在没有顺磁性剂时的峰值强度。(G)DOXYL-CH（左）和CNO（右）引起的（1-PRE）与模拟结合曲线的比较。对于预数据，分别用0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.4 mM DOXYL-CH和CNO滴定PD-L1-TC NMR样品。模拟的结合曲线n=1（无合作性，黑色虚线）和n=2（正配合度，红色虚线）分别显示在各图中。

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胆固醇结合位点的分子动力学模拟评价

我们进一步利用MD模拟评估胆固醇与PD-L1-TC的结合，这是研究蛋白质-配体相互作用的一个有价值的工具。我们首先使用AutoDock Vina 1.1.2将胆固醇在真空中固定到PD-L1-TC上(35)在上面描述的核磁共振约束下。利用PD-L1-TC的NMR结构（PDB:7DCV）作为分子对接的靶蛋白。胆固醇在1-棕榈酰-2-油酰基中与PD-L1-TC对接-序号-用Desmond 2020软件构建甘油-3-磷酸胆碱（POPC）脂质双层环境(https://schrodinger.com/desmond，于2022年1月17日访问）。胆固醇最初定位在我们的预分析确定的位置；羟基端基分别指向F257和R260，F259和R262，酰基链指向PD-L1-TC的跨膜中心(图4A).在对接过程中，5°胆固醇范围内的PD-L1-TC侧链可以自由移动。两个胆固醇分子在一个PD-L1-TC上的对接，与结合自由能没有空间冲突?4.6kcal/mol，表明PD-L1与胆固醇的相互作用是热力学稳定的。我们选择与我们的核磁共振数据最接近的对接构象作为进一步分子动力学模拟的初始模型，以评估胆固醇与PD-L1-TC结合的稳定性。

图4核磁共振衍生胆固醇结合位点的分子动力学模拟评估。

(A)模型显示胆固醇和PD-L1-TC在MD模拟轨迹上的位置（0纳秒，左至100纳秒，右）。CRAC1和CRAC2是PD-L1中与胆固醇相互作用的关键基序（绿色）。(B)详细描述了CRAC1和CRAC2在PD-L1-TC和胆固醇（绿色）上的相互作用。(C和D)结合热图显示胆固醇主要与PD-L1-TC中的CRAC1（C）和CRAC2（D）基序相互作用。橙色线显示胆固醇和PD-L1-TC之间的接触次数。(E和F)热图强度的量化显示CRAC1和CRAC2基序的接触数量。胆固醇主要通过与V253和F257的疏水相互作用以及与R260（E）的氢键和水桥与CRAC1基序相互作用。胆固醇主要通过与L255和F259的疏水相互作用以及与R262（F）的氢键和水桥与CRAC2基序相互作用。

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利用对接模型进行了三阶段MD仿真。前两个阶段是限制最小化和平衡运行使用默认的膜松弛协议在德斯蒙德。在达到平衡后，生产进入第三阶段。在100 ns模拟之后，PD-L1-TC-胆固醇复合物中选择的原子的起始位置和最终位置的RMSD图显示热收敛（图S6），均方根涨落图显示蛋白质主干和配体原子在整个轨迹上保持局部稳定（图S7）。模拟结果表明，CRAC1基序中的F257和R260以及CRAC2基序中的F259和R262可以与胆固醇结合(图4，B至E).相互作用分析表明，F257和F259通过疏水力与胆固醇相互作用，而R260和R262则通过氢键和水桥与胆固醇相互作用(图4，D和E).相对灵活的胆固醇酰基链通过疏水相互作用倾向于V253（CRAC1基序）或L255（CRAC2基序）。胆固醇与CARC1和CRAC2基序之间的结合能为?20和?分别为18 kcal/mol，表明PD-L1和胆固醇对两个基序具有紧密的结合亲和力。

CRAC基序是PD-L1-TC与胆固醇相互作用的关键

为了验证核磁共振和分子动力学模拟确定的对胆固醇结合至关重要的特定残基，我们使用丙氨酸扫描突变来替换两个CRAC基序中的每个残基。四个单突变体（PD-L1-TC^F257A型，PD-L1-TC^F259A型，PD-L1-TC^R260A型和PD-L1-TC^R262A型)用胆固醇滴定法检测。2D-TROSY光谱表明，在PD-L1-TC中加入了胆固醇^F259A型和PD-L1-TC^R262A型突变体引起的化学位移变化很少，在PD-L1-TC的核磁共振谱中只观察到微小的化学位移扰动^F257A型和PD-L1-TC^R260A型添加胆固醇的突变体（图S8）。这些结果表明突变破坏了胆固醇与PD-L1-TC的结合。对其他突变体进行检测以检测PD-L1定位：人胚肾（HEK）293FT稳定细胞表达增强型绿色荧光蛋白融合到PD-L1-TC^重量，CRAC1基序双突变体（PD-L1-TC^F257A/R260A)，CRAC2基序双突变体（PD-L1-TC^{F259A/R262A型})，以及一个双基序（CRAC1和CRAC2）四重突变体（PD-L1-TC）^4米).在CRAC1和CRAC2单基序突变体中（PD-L1-TC^F257A/R260A和PD-L1-TC^{F259A/R262A型})细胞表面PD-L1-TC水平与表达野生型PD-L1-TC的细胞表面水平相当^重量;双基序突变体PD-L1-TC^4米在膜上未观察到（图S9）。这表明，当一个胆固醇结合位点被破坏时，PD-L1-TC可以维持正常的表面水平，但当两个胆固醇结合位点被破坏时，膜的结构完整性就丧失了。

细胞实验进一步验证了CRAC基序与PD-L1稳定性的关系。全长野生型PD-L1（PD-L1^重量)和PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型突变体在内源性PD-L1–敲除RKO细胞中单独表达（图S10A），并使用Western blot分析PD-L1蛋白的表达。与PD-L1相比，所有突变体的蛋白表达均明显降低^重量(图5A)而突变体和野生型的PD-l1mrna水平相似（图S10B）。与野生型相比，PD-L1的细胞表面表达（通过流式细胞仪监测）也显示出四个单突变体的细胞表面表达明显下降(图5B).CHX-chase实验表明PD-L1在四个突变体中降解速度更快(图5C).此外，与表达野生型蛋白的突变体相比，在MG132存在下检测到更高的泛素化水平(图5D).CRAC基序突变引起的PD-L1抑制影响了PD-L1与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的结合。当含有人PD-1和免疫球蛋白G（IgG）Fc片段的融合蛋白(25)与表达PD-L1的RKO细胞一起培养^重量流式细胞术显示突变体的平均荧光强度（MFI）显著降低。这表明CRAC突变体PD-L1膜表达的降低导致PD-1结合能力的显著降低(图5E).总的来说，这些结果表明CRAC基序对于PD-L1和胆固醇之间的相互作用以及PD-1与PD-L1的结合至关重要。

图5CRAC基序是PD-L1与胆固醇相互作用的关键。

(A)外源性PD-L1的细胞水平^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型在内源性PD-L1中，用Western blot分析RKO稳定细胞。(B)细胞膜PD-L1的流式细胞术分析^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型在内源性PD-L1–敲除RKO稳定细胞中。条形图描述了相对于控制的折叠变化；所示数值为四个独立实验的平均值±标准差(n=4）。用单因素方差分析确定统计学差异。(C)CHX-chase法显示PD-L1降解^重量还有变种人。RKO稳定细胞表达PD-L1^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型用50μmCHX处理2、4、6或8小时，然后用Western blot检测PD-L1（如左图所示）。使用ImageJ分析（如右图所示）量化相对PD-L1蛋白（剩余PD-L1）的强度。两个独立的实验进行了相似的结果。(D)野生型PD-L1（PD-L1）泛素化水平^重量)以及突变蛋白PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型在HEK293FT电池中。用抗PD-L1抗体免疫沉淀后，用V5免疫印迹法测定泛素化水平。两个独立的实验进行了相似的结果。(E)流式细胞术检测PD-L1在RKO稳定细胞中的结合^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型或PD-L1^R262A型. The是的轴表示PD-1平均荧光强度（MFI）。数据显示为三个独立实验的平均值±标准差(n=3）。用单因素方差分析确定统计学差异。

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讨论

胆固醇在癌症的预防和治疗中起着至关重要的作用，因此在癌症研究中引起了越来越多的关注。累积的证据表明胆固醇影响细胞膜蛋白的结构、动力学和功能(36,37).尽管有许多胆固醇调节的例子，但由于胆固醇的体积小，动力学复杂，溶解性差，其潜在的机制一直是个谜。核磁共振波谱是一个通用的工具，通常用来填补在理解脂类和膜蛋白之间的相互作用的空白。我们以前应用核磁共振技术证明酸性磷脂通过吸引膜旁区域的碱性残基和抑制下游降解来调节PD-L1的稳定性(38).在这里，我们提供了视觉和生化证据，胆固醇本身可以稳定细胞膜表面的PD-L1。我们进一步证实胆固醇直接与PD-L1跨膜区结合，这在PD-L1的稳定性中起关键作用。人PD-L1中有两个CRAC基序与胆固醇结合；突变的CRAC1或CRAC2基序破坏了PD-L1中胆固醇的结合，增强了PD-L1的降解。序列比对分析表明，人的CRAC1基序在同源序列中并不保守；F257被缬氨酸或丙氨酸取代，R260被其他物种的半胱氨酸或酪氨酸取代（图S1）。相反，CRAC2基序高度保守，苯丙氨酸残基通过π-π相互作用与胆固醇环结合，精氨酸或赖氨酸残基通过氢键与胆固醇的-OH基团结合。这表明结合一个胆固醇分子足以稳定大多数物种的质膜上的PD-L1。CRAC2基序可能是调节PD-L1跨物种稳定性的关键胆固醇结合基序，而额外的CRAC1胆固醇结合位点特别有助于人类PD-L1的稳定。胆固醇与人PD-L1结合的化学计量比可能不同于其他同系物。

通常，由于胆固醇在蛋白质样品膜系统中的强烈分配，很难确定胆固醇与膜蛋白的化学计量比。PD-L1的小尺寸和高动态性进一步阻碍了用x射线晶体学或低温电子显微镜测定有多少胆固醇分子与这种跨膜蛋白结合。然而，我们的核磁共振滴定数据表明PD-L1和胆固醇之间存在正的协同结合，PD-L1-TC可以与多个胆固醇分子结合(图3G).PD-L1与两个胆固醇分子的MD模拟也显示出良好的稳定性，CARC1和CRAC2对PD-L1和胆固醇的相互作用可以共存。这些结果表明，人类PD-L1有可能在两个相反的CRAC基序上同时结合两个胆固醇分子，形成三明治状结构(图6).PD-L1中两个胆固醇分子的独特配置在增强PD-L1的稳定性，从而使癌细胞逃避免疫监视方面起着重要作用。

图6描述胆固醇对PD-L1稳定性影响的示意图。

胆固醇可以直接与PD-L1的跨膜结构域结合，在细胞膜上稳定PD-L1。用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a（HMG-CoA）还原酶抑制剂（辛伐他汀）或胆固醇消耗试剂（MCD）降低胆固醇水平，通过促进PD-L1泛素化和降解来降低膜结合PD-L1的水平。CRAC基序的突变也有类似的作用，降低细胞表面的PD-L1水平。放大区域显示PD-L1-TC的两个胆固醇结合位点的关键残基（CRAC1:F257/R260；CRAC2:F259/R262）。

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我们的研究结果进一步证明，突变CRAC基序破坏了PD-L1与胆固醇的相互作用，降低了PD-L1的细胞水平(39)或溶酶体降解(25)棕榈酰转移酶DHHC3的棕榈酰化(40)但目前还不清楚胆固醇对哪种途径有影响。我们的数据显示PD-L1突变体增加了泛素化水平；胆固醇有可能稳定膜中的PD-L1，抑制下游泛素依赖性降解。然而，我们不能排除胆固醇可能增强膜结合PD-L1的棕榈酰化介导的稳定性的可能性。PD-L1细胞水平的降低也可能是破坏PD-L1-胆固醇相互作用的多种途径的综合结果，包括促进PD-L1降解和损害DHHC3棕榈酰化。还需要进一步的实验来研究胆固醇是否或如何影响这些途径。

林等等。最近报道他汀类药物通过抑制蛋白激酶B（AKT）和β-catenin信号转导降低癌细胞PD-L1的表达(41).另一项研究显示辛伐他汀通过抑制长的非编码RNA SNHG29的表达来抑制PD-L1的表达，从而促进抗肿瘤免疫(42).两项研究均显示他汀类药物的间接作用比单纯降低癌细胞胆固醇更为复杂；相反，它们会引起其他PD-L1相关因子活性的改变，而这些因子反过来又会下调PD-L1的表达。相比之下，本研究揭示了胆固醇对PD-L1的直接作用。除了使用辛伐他汀作为降胆固醇药物外，我们还用MCD处理细胞，以降低细胞膜中的胆固醇水平；作为回应，PD-L1的细胞水平降低(图1、B和C).此外，当胆固醇加入RKO细胞时，PD-L1水平略有升高(图1A)当去除K562细胞中PD-L1表达的刺激因子（IFN-γ）时，在胆固醇的存在下保持稳定（图S3D）。总之，我们的结果揭示了胆固醇在稳定癌细胞膜上PD-L1的独特作用。

抗PD-L1药物通过恢复T细胞的杀伤活性，在治疗多种癌症患者方面取得了巨大的临床成功(43,44).然而，目前基于PD-L1的癌症治疗出现了一些问题，尤其是增加了患者的耐药性(45)，强调了替代抗肿瘤策略的必要性。据报道，小分子抑制剂可使患者致敏以达到治疗效果(46).我们观察到胆固醇可以直接与PD-L1结合并增强PD-L1在癌细胞中的表达，这为开发小分子抑制剂来去除或替代胆固醇、降低PD-L1水平和抑制肿瘤生长提供了独特的策略。设计或筛选胆固醇的竞争性化学类似物可能是提高患者对免疫治疗反应的补充策略。胆固醇在分子水平上直接参与PD-L1的调节，有望有助于抗癌治疗的发展。

材料和方法

试剂和电池

脂类和洗涤剂（DMPC、DH⁶从Avanti极性脂质（美国阿拉巴马州雪花石膏）中获得PC和25-羟甲基胆固醇。自由基3β-DOXYL-5α-胆甾烷购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。核磁共振波谱实验的稳定同位素来自剑桥同位素实验室（美国马萨诸塞州特克斯伯里）。甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（10494-1-AP）和辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗鼠IgG（SA00001-1）从Proteintech（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）获得。抗人PD-L1抗体（ab213524），兔单克隆IgG（同型对照）（ab172730)山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab97051）购自英国剑桥Abcam。抗V5抗体（96025）和Alexa-Fluor 647-结合山羊抗人IgG（A21445）从Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）获得。别藻毒素（APC）抗人PD-L1抗体（329708）和APC小鼠IgG2b（同型对照）（400322）从BioLegend（加利福尼亚州圣地亚哥）获得。小鼠抗兔IgG（构象特异性）（5127S）、PD-L1胞外结构域特异性兔单克隆抗体（86744S）、Alexa-fluor488-结合山羊抗兔IgG（4412S）和Alexa-fluor647-结合山羊抗兔IgG（4414S）均来自细胞信号技术（Danvers，MA，USA）。重组人PD-1fc嵌合蛋白（1086-PD050）购自美国明尼苏达州明尼阿波利斯市研发系统公司。MG132、MCD、CHX和辛伐他汀从MedChem Express（美国新泽西州蒙茅斯枢纽）获得。胆固醇和其他生化试剂从Sigma-Aldrich购买。大肠杆菌DH5α（C2987I）和BL21（DE3）（C2527I）从新英格兰生物实验室（美国马萨诸塞州伊普斯维奇）购买。HEK293FT细胞系是孙立新[中国科学院分子细胞科学卓越中心（CEMCS）]的礼物。RKO细胞系是来自复旦大学（复旦大学）的礼物。其他细胞系均来自中国科学院细胞库。

野生型和突变型PD-L1-TC的表达与纯化

人PD-L1的TC结构域（残基232-290），命名为PD-L1-TC，由GenScript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）合成。表达式构造是通过融合PD-L1-TC在pMM-LR6载体（哈佛医学院S.C.Blacklow的礼物）中，将His9 TrpLE表达序列的C末端片段，在PC-L1-TC和His9-TrpLE之间添加蛋氨酸，用于溴化氰（CNBr）的裂解。利用标准聚合酶链反应（PCR）技术生成突变体结构，并通过DNA测序进行确认。用于核磁共振样品制备，转化E、 大肠杆菌BL21（DE3）细胞在M9最小培养基中生长，培养基中添加了Centrum成体复合维生素和稳定同位素。培养物在37℃下生长到600 nm（OD）的光密度₆₀₀)0.6至0.8，然后冷却至18°C，然后用250μM异丙基β进行诱导-d-在18°C下过夜。对于完全氘化的蛋白质，细菌培养在99.8%D₂O（Sigma-Aldrich）和氘化葡萄糖（剑桥同位素实验室）。表达的融合蛋白用镍亲和树脂（Thermo Fisher Scientific）提取纯化，然后用80%甲酸进行CNBr消化。消化物用水透析以除去大部分甲酸，冷冻干燥，并在80%甲酸中重新溶解。使用Zorbax 300SB-C3 PrepHT柱（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉市），采用反相高效液相色谱法进一步纯化PD-L1-TC蛋白，洗脱梯度为40%（v/v）乙腈（ACN）和0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）至100%（v/v）ACN和0.1%（v/v）TFA。通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析鉴定了与纯PD-L1-TC肽相对应的组分。所有突变蛋白的表达和纯化遵循相同的方案。

PD-L1-TC重组为双核细胞

为了重组野生型和突变型PD-L1-TC蛋白，将1至2 mg纯化和冻干的蛋白质与10 mg质子化或氘化的DMPC（Avanti极性脂质）混合，并溶解在六氟异丙醇（HFIP）中。混合物在氮气流下缓慢干燥成薄膜，然后冻干过夜。在0.5 ml含有60 mM质子化或氘化DH的25 mM MES缓冲液（pH 6.5）中重新溶解干膜⁶PC（Avanti极性脂质）。DMPC:DH⁶用1D核磁共振监测PC比值，以验证问价值观。最终的核磁共振样品含有0.4至0.5 mM PD-L1-TC（野生型或突变型）、约30 mM DMPC和~60 mM DH⁶PC、25 mM MES（pH 6.5）和10%D₂O、 对于所有的NOE实验，用DMPC和DH重组蛋白质⁶含氘化酰基链的PC（Avanti极性脂质）。

双核核磁共振共振的归属

所有的核磁共振波谱都是在310K下，在装有低温探针的Bruker Avance III光谱仪（600或900 MHz）和配备三重共振冷探针的安捷伦DD2光谱仪（800或700 MHz）上获得的。利用NMRPipe对核磁共振数据进行处理(47)并用XEASY分析(48).通过一系列标准的三重共振实验，包括TROSY版本的HNCA、HN（CO）CA、HN（CA）CO、HNCO和HNCACB，对主链化学位移进行了序列特异性分配(¹⁵N，¹³C、 85%²H） –在¹频率为600兆赫。侧链分配用¹⁵N NOESY-HSQC公司(49)，诺西-¹³C HSQC，以及¹³C（CT）–HSQC实验，也为主干分配提供信息。¹⁵N-编辑和¹³C编辑的NOESY数据均以120ms混合时间获得。

PD-L1-TC双核结构的NMR计算

用XPLOR-NIH程序计算PD-L1-TC结构(50).这些结构是通过内单体、主链二面体和氢键约束得到的。利用TALOS+程序，根据化学位移确定骨架二面体约束(31).在XPLOR计算中，将TALOS+程序中的二面体约束和不确定性作为约束条件；TALOS+程序认为N、Cα和C′化学位移导出的ψ和ψ值的统计数据“良好”。对跨膜段的残基也进行了氢键限制。对于每个氢键，定义了两个距离限制：对于HN-O距离，为1.8-2.0?，对于N-O距离为2.7-3.0?。总共计算了200个结构，选择了15个最低能量结构作为最终的结构系综。不同核的赋值完备性为：N，92.5%；H、 94.87%；一氧化碳，97.50%；钙，97.50%；HA，95.35%；甲基C，97.30%；甲基氢，97.30%；其他H值为71.95%。

胆固醇滴定法

由于胆固醇溶解度低，不同量的胆固醇首先溶解在三氯甲烷中。然后将这些溶液添加到溶解在HFIP中的0.4 mM PD-L1-TC肽和30 mM DMPC中。每种混合物在氮气流下干燥成薄膜，然后进行隔夜冷冻干燥。将干燥的薄膜溶解在含有60 mM DH的500μl NMR缓冲液（25 mM MES，pH 6.5）中⁶核磁共振样品的最终胆固醇浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mM。对于每个滴定实验，记录2D TROSY-HSQC光谱以监测化学位移变化。复合化学位移（δ_梳子)使用以下公式计算每个残留物的差值(51)

Δδ梳子=(ωHΔδH)2+(ωNΔδN)2????????????????????√$$<trans\; data-src="?">?</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="\delta ">\delta </trans>}}_{\text{<trans data-src="comb">梳子</trans>}}<trans\; data-src="=">=</trans>\sqrt{{<trans\; data-src="(">(</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="\omega ">\omega </trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="H">H</trans>}}<trans\; data-src="?">?</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="\delta ">\delta </trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="H">H</trans>}}<trans\; data-src=")">)</trans>}^{\mathrm{<trans\; data-src="2">2</trans>}}<trans\; data-src="+">+</trans>{<trans\; data-src="(">(</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="\omega ">\omega </trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="N">N</trans>}}<trans\; data-src="?">?</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="\delta ">\delta </trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="N">N</trans>}}<trans\; data-src=")">)</trans>}^{\mathrm{<trans\; data-src="2">2</trans>}}}$$

（一）

式中Δδ_H和Δδ_N化学位移变化（百万分之几）在¹H和¹⁵分别是N维和ω_H和ω_N是归一化因子（ω_H=1.00和ω_N=0.15）。

按照上述方法，用0.4 mM肽和30 mM DMPC制备单个突变体的所有胆固醇滴定。二维¹H-¹⁵在没有或存在1.5毫米胆固醇的情况下记录N TROSY-HSQC光谱。所有核磁共振滴定实验在37°C下在700 MHz安捷伦光谱仪上进行。

滴定前

如前所述，进行DOXYL-CH和CNO滴定(33).简单地说，我们将PD-L1-TC和DMPC与自旋标记的胆固醇衍生物混合在每种有机溶剂中，在氮气流下干燥溶液，冻干过夜以除去有机溶剂，然后将混合物溶解在具有DH的NMR缓冲液（25mmmes，ph6.5）中⁶在每个滴定点，记录2D TROSY-HSQC光谱，以测量残留物比PRE，此处定义为我/我₀;我和我₀分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.4 mM处的顺磁性试剂DOXYL-CH或CNO的峰值强度。峰强度用CcpNmr分析(52).在最终滴定点后，将新制备的抗坏血酸储备液（500 mM）添加到NMR缓冲液中，以达到10 mM的最终浓度，以恢复展宽的峰。为了更定量地解释滴定前的数据，我们估计了表观离解常数(K_d)使用公式2.预读数用实验（1）绘制?PRE）与[DOXYL-CH]或[CNO]比较，以估算表观K_d

1?之前=B最大值[PCD公司]nKd公司n+[PCD公司]n$$\mathrm{<trans\; data-src="1">1</trans>}<trans\; data-src="?">?</trans>\text{<trans data-src="PRE">之前</trans>}<trans\; data-src="=">=</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="B">B</trans>}}_{\text{<trans data-src="max">最大值</trans>}}\frac{{<trans\; data-src="[">[</trans>\text{<trans data-src="PCD">PCD公司</trans>}<trans\; data-src="]">]</trans>}^{\mathrm{<trans\; data-src="n">n</trans>}}}{{\text{<trans data-src="Kd">Kd公司</trans>}}^{\mathrm{<trans\; data-src="n">n</trans>}}<trans\; data-src="+">+</trans>{<trans\; data-src="[">[</trans>\text{<trans data-src="PCD">PCD公司</trans>}<trans\; data-src="]">]</trans>}^{\mathrm{<trans\; data-src="n">n</trans>}}}$$

（二）

其中PRE是强度与初始强度之比(我/我₀);[PCD]是顺磁性胆固醇衍生物（PCD）、DOXYL和CNO的浓度；B_最大值为DOXYL-CH和CNO饱和时的最大值；n表示希尔系数；Kd是离解常数。

对于Gd-DOTA和16-DSA滴定，我们准备了0.4mm¹⁵N-标记的PD-L1-TC在双核中重组。将水溶性顺磁剂Gd-DOTA分别在0、0.5、1、2、4、8、10、15和20 mM处滴定到500μl的双室样品中。将亲脂性顺磁性剂16-DSA滴定到500-μl的双核样品中，在每个滴定点，一个2D¹⁵用700 MHz安捷伦光谱仪获得TROSY-HSQC光谱。存在时的峰值强度(我)和缺席(我₀)从核磁共振波谱图对顺磁性剂进行了CcpNmr分析(52).通过拟合峰强度衰减作为顺磁性剂的函数，得到了残基特异性前置放大器。对于单个峰，使用原点拟合我/我₀与顺磁性剂浓度的关系式如下(公式3)

我我0=1?之前放大器(1?e?[宾夕法尼亚州]τ)$$\frac{\mathrm{<trans\; data-src="I">我</trans>}}{{\mathrm{<trans\; data-src="I">我</trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="0">0</trans>}}}<trans\; data-src="=">=</trans>\mathrm{<trans\; data-src="1">1</trans>}<trans\; data-src="?">?</trans>{\mathit{\text{<trans data-src="PRE">之前</trans>}}}_{\mathit{\text{<trans data-src="amp">放大器</trans>}}}<trans\; data-src="(">(</trans>\mathrm{<trans\; data-src="1">1</trans>}<trans\; data-src="?">?</trans>{\mathrm{<trans\; data-src="e">e</trans>}}^{<trans\; data-src="?">?</trans>\frac{<trans\; data-src="[">[</trans>\mathit{\text{<trans data-src="PA">宾夕法尼亚州</trans>}}<trans\; data-src="]">]</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\tau ">\tau </trans>}}}<trans\; data-src=")">)</trans>$$

（三）

式中，[PA]是顺磁性剂（Gd-DOTA）的浓度，τ是衰变常数。

PD-L1-敲除RKO稳定细胞的产生

利用pLKD-CMV-G和PR-U6-shPD-L1和pLVX-hPD-L1-IRES表达载体，建立了一株内源性PD-L1敲除的RKO稳定细胞系^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型为了包装慢病毒，用两种包装质粒（psPAX2和pMD2.G）和脂质体2000试剂（Invitrogen，Waltham，MA，USA）将pLKD-CMV-G&PR-U6-shPD-L1和pLVX-hPD-L1-IRES转染HEK293FT细胞。转染后8h更换培养基，24、48h收集含病毒上清液。离心上清液用0.45μm过滤器过滤。RKO细胞以50%的融合率在含有慢病毒和聚布伦的培养基中培养。感染后用BD流式细胞分选仪收集双阳性细胞。用来击倒的短发夹rna序列PD-L1结果如下：无靶（NC），5′-cctaaggtaagtgcgccctcg-3′；sh1，5′-GCATTTGCTGAACGCATTT-3′；sh2，5′-CCGCTGCATGATCAGCTAT-3′；和sh3，5′-ccagcactgaaatcaa-3′。表达sh3的细胞显示出最佳的敲除效率，因此选择用于所有实验的PD-L1-敲除RKO稳定细胞。

实时定量PCR分析

用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA；用基因组DNA清洁的Evo-M-MLV RT试剂盒（AG11705，精准生物技术，湖南长沙，中国）反向转录1μg总RNA。采用ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）和SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒（AG11701，Accurate Biotechnology）进行逆转录定量（RT-q）PCR。基因表达用2^???Ct方法(53)表现为褶皱变化。??Ct是?C实验样品和对照样品的t值；?Ct是C给定样本的感兴趣基因和内部参考基因的t值。人类PD-L1mRNA被标准化为GAPDH公司基因。用于RT-qPCR的引物序列如下：人PD-L1，5′-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3′（正向）和5′-tgcagcaggttaattgtttt-3′（反向）；人类GAPDH，5′-aaggtgaggtcaggtcaa-3′（正向）和5′-aatgagggtcattgagg-3′（反向）。

共焦成像分析

对于免疫荧光，RKO细胞以大约50%的融合率接种在玻璃底培养皿（801001，NEST，无锡，江苏，CN）。去除培养基后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。然后用4%多聚甲醛（PFA）（P0099，Beyotime Biotechnology，Shanghai，CN）固定15分钟，然后用PBS洗涤三次。在室温下用5%的正常山羊血清（36119ES03，Yeasen Biotechnology，Shanghai，CN）封闭30分钟后，将细胞与抗PD-L1一级抗体在4℃下培养过夜。用PBS冲洗3次后，用Alexa-Fluor 488-偶联山羊抗兔IgG在室温下染色2小时，然后用PBS洗涤3次10分钟。成像前，细胞用Slowfed钻石防褪色试剂4′处理，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（S36968，赛默飞世尔科技公司）并用盖玻片密封。在装有100倍油浸物镜的徕卡SP8共聚焦显微镜上观察细胞。

免疫印迹

对于Western blot分析，用PBS洗涤细胞，然后在添加有1 mM苯甲磺酰氟醚（PMSF）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（P8340，Sigma-Aldrich）的放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液中裂解[150 mM NaCl，1%Triton X-100，2.5 mM焦磷酸钠，1 mM EDTA和50 mM tris HCl（pH 7.4）]中裂解。蛋白质浓度用双辛酸法测定。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，并在120毫安时将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜（IPVH00010，默克密理博，达姆施塔特，德国）30分钟。在室温下用5%牛血清白蛋白在TBS-T缓冲液（50 mM tris、1.37 mM NaCl和2.7 mM KCl，pH 8.0，0.05%吐温20）中封闭1小时后，在4°C下用抗体（PD-L1抗体，1:5000；GAPDH抗体，1:5000）培养过夜。用TBS-T缓冲液冲洗三次，然后在室温下与HRP结合的羊抗兔IgG抗体（1:5000）孵育1h。用TBS-T缓冲液洗涤三次后，使用ECL Western印迹底物（T7101A，Takara，San Jose，CA，USA）检测蛋白质条带，并使用ImageJ软件进行分析(54).

流式细胞术检测细胞表面PD-L1

为了检测细胞表面的PD-L1，收集细胞并用PBS冲洗三次。细胞再悬浮于200μl PBS中，与APC结合的抗人PD-L1抗体（1:50）在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，用流式细胞术（BD，LSRFortessa）分析染色细胞。数据分析采用FlowJo软件。

菲利平Ⅲ染色

菲利平III溶于乙醇中，最终浓度为5 mg/ml。细胞用4%PFA固定，FilipinⅢ（50μg/ml）染色30min，显影后用slowfed金刚石抗蚀剂处理。使用徕卡SP8共焦显微镜采集图像，并使用ImageJ软件进行分析(54).

PD-L1泛素化试验

为了检测HEK293FT细胞中PD-L1泛素的泛素化，将PD-L1和V5泛素结构体转染细胞48小时，然后用20μM MG132孵育4小时后分析。然后在含有1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解物（每个样品200μl）与抗PD-L1抗体（1:50）在4°C下培养过夜，然后在室温下用蛋白A/G混合磁珠（88802，Thermo Fisher Scientific）拉下1小时。用TBS-T缓冲液洗涤三次，用2×SDS负载缓冲液在95℃下洗脱10分钟。用抗V5抗体（R96025，Thermo Fisher Scientific）免疫印迹法测定PD-L1的泛素化。

PD-L1蛋白稳定性分析

在乙醇中制备30mm胆固醇储备溶液，然后添加到RKO细胞中，将其镀在六孔板中，使其达到80-90%的融合度，以分别达到10、20和50μM的最终胆固醇浓度。以相应体积的纯乙醇作为对照。用胰酶消化法收集细胞，分别于0、2、4小时移入试管中。收集的细胞用PBS洗涤两次，然后用100μl RIPA缓冲液（含有1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物）在冰上孵育30分钟。收集裂解物并在18000 rpm和4℃下离心15分钟。收集上清液，用抗PD-L1抗体进行Western印迹分析。上述实验过程也在CHX存在的情况下进行，在RKO细胞中加入50mmchx二甲基亚砜（DMSO）储备液，以达到50μmchx的最终浓度，并以DMSO作为对照。

膜PD-L1蛋白稳定性分析

用IFN-γ（50u/ml）预处理K562细胞12小时，用APC-PD-L1抗体标记细胞表面PD-L1。将细胞洗涤三次以去除未结合抗体和IFN-γ，然后在37℃下培养，以允许PD-L1在没有和存在胆固醇的情况下循环使用。在0、2、4和6小时收集样本，并立即在冰冷的PBS中稀释，以停止进一步回收。细胞洗涤两次，在PBS中重新悬浮，然后用流式细胞仪按上述相同方案进行分析。

PD-L1/PD-1–结合分析

为了测量PD-1和PD-L1之间的蛋白质相互作用，将细胞接种到六孔板中，使其达到90-100%的融合率。收集细胞并转移到离心管中，PD-L1^重量，PD-L1^F257A型，PD-L1^F259A型，PD-L1^R260A型和PD-L1^R262A型用重组人PD-1fc嵌合蛋白（5μg/ml）（1:80）在室温下将RKO稳定细胞悬浮在PBS中30ming3分钟后，去除上清液。用PBS冲洗细胞三次，每次10min。然后，在室温下用抗人Alexa-fluor647染料结合抗体（1:400）培养30分钟。处理后的细胞用PBS轻轻冲洗三次，然后用流式细胞仪分析。细胞不受光照的影响。流式细胞术数据用FlowJo软件分析。

MD模拟

在OPLS2005力场作用下，将PD-L1的TMD插入POPC膜中，用显式溶剂单点电荷水溶剂化(55).将水盒的周期边界设置为X:20氹、Y:20氻和Z:30氹，形成正交的形状，通过加入反离子和0.15m的NaCl进行中和。仿真实现了鼻-胡佛温度耦合(56)还有玛蒂娜·托比亚斯·克莱恩的方法(57)采用各向同性标度控制常压和温度系综类下的温度（300k）和大气压（1atm）；这代表了具有恒定法向压力和侧向表面张力的等温等压系综，特别是对于含膜系统。粒子网格法(58)用于计算网格间距为0.8?的长程静电相互作用。范德华和短程静电相互作用在9.0°时被平滑地截断。轨迹帧设置为10ps，能量频率设置为2ps以记录动态变化。在运行每个MD生产模拟之前，使用Desmond中启用的默认膜松弛协议最小化和平衡系统，该协议包括一系列约束最小化和一个缓慢达到平衡的加热过程。放松2-ns后，每个系统（无论是CRAC1还是CRAC2）都是通过100ns模拟分析的，其中胆固醇和PD-L1-TC的侧链不受限制，而蛋白质的主链原子受到限制（0.1 kcal/mol），以保持蛋白质的构象与我们的核磁共振结构一致。

统计分析

GraphPad PRISM v8用于统计分析。非配对双面学生的t采用检验或单因素方差分析（ANOVA）对每个实验所示的不同组独立样本进行比较。免疫荧光结果基于三个独立的细胞培养实验，并用imagejv1.53n进行分析。流式细胞术的结果基于三个独立的实验，并用FlowJo v10进行分析。P<0.05被认为具有统计学意义。其他信息可在地物图例中找到。