生存期超十年！揭开CAR T疗法长期起效的秘密

　　

2010年，两名罹患晚期慢性淋巴细胞白血病的患者接受了CAR T细胞疗法，并在短短几个月内完全缓解。直到2021年，两名患者的癌症都没有复发。到目前为止，治疗后获得长期成功的秘密仍是一个谜。最初临床研究者们采用10x Genomics的单细胞免疫分析技术研究了CAR T细胞在过去十年中如何进化，才能持续防止癌症复发——这些令人惊叹的结果代表我们朝着找到治愈方法迈出了关键性的一步。

药物机制：认知落后于治疗

“实际上，大量治疗方法是这样开发的：老式观察、反复试验，再加运气。具有讽刺意味的是，对药物如何起作用的详细科学认知往往是在这个过程快速结束时才出现的”(1)。

正如这句话所表明的，与普遍认为的情况相反，科学家和医生并不总是确切地了解药物如何缓解他们所治疗疾病的复杂症状。令人惊讶的是，对药物作用机制的深入了解往往是在治疗成功之后。

“从历史上看，对药物机制的了解一直落后于治疗，有时甚至落后数十年之久。一些广为人知的药物——用于缓解疼痛的对乙酰氨基酚、用于应对感染的青霉素以及用于治疗双相情感障碍的锂，到今天仍然是科学之谜”(1)。

为什么会这样呢？一方面，患者当前的需求会实时推动创新决策。正如巴斯德所说的，“命运总是垂青有准备的人”(1)。通常也需要更可靠的试验以及时间来积累对机制的了解。可用的技术也是一个限制因素。治疗实施时的研究工具可能不够先进，缺乏足够的分辨率来了解药物疗效的细胞和分子基础。

CAR T疗法的演化

最近的一个例子展示了药物开发过程中这一令人惊讶的特征，那就是对首例CAR T细胞输注的长期疗效的研究(2)。这种癌症免疫疗法曾在2010年的临床试验中用于两名男性，他们的白血病自此得到缓解，迄今已超过10年。

CAR T细胞是来源于患者自身的T细胞，它们经过改造后表达一种称为CAR（嵌合抗原受体）的合成受体，一旦将T细胞重新输注到体内，它们就能够对癌细胞开展靶向攻击(3,4)。

2010年治疗后的初步观察结果显示，患者存在有效的抗白血病作用，定量PCR分析检测到CAR T细胞的扩增，这些细胞在治疗后至少6个月仍持续存在于血液和骨髓中(5)。研究人员采用多色流式细胞术对CAR T细胞进行功能表征，揭示了CD4+ 细胞的独特区室，这些区室似乎获得了中枢记忆表型的特征——T细胞处于初始状态，但对癌症抗原的刺激敏感(6)，而且CD8+ 细胞具有很强的效应记忆特征，这意味着它们经历了长时间且强劲的抗原暴露。这些早期观察结果令人鼓舞，表明中枢和效应记忆T细胞的混合群体能够支持CAR T细胞的持续存在(5)。然而，问题仍未解决——它们能够持续多久？即使最后没有癌症抗原，CAR T还能持续存在吗？如果真的存在，那是为什么？

时间一晃来到了2021年。。。

“十年过去了，白血病细胞不复存在，但CAR-T细胞仍然在巡逻并监视白血病。”

——Carl June博士

骨髓性白血病的样本。CAR-T癌症治疗领域已经发展到包括白血病，淋巴瘤和其他癌症的治疗。图片来源：WELLCOME COLLECTION

自2010年以来，许多其他的癌症患者也接受了CAR T细胞疗法，但很少有人能获得长期疗效。更常见的是，患者癌症复发，这就使得研究成功病例的潜在生物学机制变得更加紧迫(3)。于是，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的科学家团队（包括细胞免疫疗法中心主任Carl June博士和主要作者、医学院研究教授J. Joseph Melenhorst博士）采用一种新方法来分析一些旧样本——冷冻保存的血液样本，来自完全缓解的两名患者(2)。

为了评估输注的CAR T细胞的长期潜能和克隆稳定性，他们首先从10个纵向样本中分离出CAR+ T细胞，这些样本是在治疗后1个月到9年的时间内连续取自两名患者的(2)。然后，他们采用多种技术（包括单细胞RNA测序以及细胞表面蛋白分析和免疫组库测序）来捕获CAR T细胞的整体概况。单细胞分析显示CAR产品有一些令人惊讶且以往未发现的特征，这些特征可能在细胞疗法的长期成功中发挥重要作用。

单细胞免疫分析揭示CAR T的详细信息

令人惊讶的细胞毒性CD4+ CAR T细胞在晚期应答中占主导

最初使用CyTOF数据，研究团队能够确定纵向样本中CAR T细胞的组成随时间发生明显变化，其标志是CD8+ 向CD4+ 的转变。例如，对于一名患者，他们发现在1.8个月时CD4+ 细胞占CAR T细胞的15.9%，而到治疗后的第9年增加到97%(2)。CD8+ CAR T细胞表现出早期增殖，但CD4+ 细胞的表达特征（包括Ki67的高表达）显示细胞有着更强劲的增殖趋势。

利用在9.3年时间点采集的患者PBMC，作者随后开展了单细胞T细胞受体（TCR）测序，并结合单细胞RNA测序和细胞表面蛋白分析（CITE-seq），以获得克隆性方面的更多无偏向见解，以及定义后期的CD4+ CAR T细胞群体的转录组和蛋白质组特征。与正常的T细胞相比，CAR T细胞的克隆多样性显著降低，前3种克隆型占CAR T细胞的90%以上。此外，CAR T细胞还表现出持续增殖的转录组特征，包括PCNA、MCM6和TOP2A等基因的表达(2)。

这种CD4+ 区室在长期缓解的情况下成为占优势的CAR T细胞群，但也存在一些非常规的特征，比如细胞毒性。CD4+ 细胞的特点是编码与细胞毒性相关的酶的基因显著上调，包括GZMK和GZMA。CITE-seq的数据还显示了激活标志物CD38和HLA-DR的上调。同样地，转录组数据显示了编码细胞因子白介素10（IL-10）和IL-32的基因的上调，这反映了CAR T细胞的功能活性。总的来说，这些数据表明长期存在的CD4+ CAR T细胞具有功能活性，不会随着时间而耗竭(2)。

鉴定出一种新的CD4-CD8- CAR T细胞群

尽管2010年的流式细胞术分析揭示出清晰的CD4+和CD8+区室，但这项后续研究揭示了第三个独特的CD4-CD8- CAR+ 群体——这个沉默的群体在早期随着CD8+ CAR T细胞出现，但因为它不携带经典的细胞表面标志物而隐匿起来。第3个月和第3年采集的患者PBMC的转录组数据证实了一个双阴性的细胞簇，其读数映射到5’ CAR构建体，表达TRDV1和TRGV4，但缺乏TCRαβ克隆型。因此，这些细胞被注释为γδ CD4-CD8- CAR T细胞。

其他CAR T细胞亚群的存在，以及在CD4、CD8和γδ T细胞表型之间灵活转换的潜力，也许有助于延长活性疗法的寿命——“多种细胞可能在起作用，也许不止一种细胞更好”（Marcela Maus博士；3）。

成功的疗法需要细胞层面的见解

这项研究为我们认识CAR T细胞随时间的演化增添了宝贵见解，也代表我们的癌症治疗方法又向前迈出了关键一步。对于癌症研究那不可捉摸的终极目标——治愈来说，长期缓解是重要前兆。有了这些成功治疗的例子可以学习，我们就有希望继续改进当前的治疗方法，让更多的癌症患者实现长期缓解。

这也是一个技术进步的故事。单细胞多组学分析技术的进步为研究CAR T细胞打开了大门，并带来更高的分辨率和更广的覆盖范围。尽管我们知道这种疗法有效，但在强大技术的协助下，“如何起效”变得越来越清晰。

若想了解这项研究的更多信息，请阅读参考资料2。

参考资料：

1. Johnson C. “One Big Myth about Medicine: We Know How Drugs Work.” The Washington Post, WP Company, 25 Nov. 2021, https://www.washingtonpost.com/news/wonk/wp/2015/07/23/one-big-myth-about-medicine-we-know-how-drugs-work/.

2. Melenhorst J, et al. Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature 602: 503–509 (2022). doi: 10.1038/s41586-021-04390-6

3. Chen A. “Researchers Label Early CAR-T Therapy Patient 'Cured' after Living a Decade without Cancer.” STAT, 7 Feb. 2022, https://www.statnews.com/2022/02/02/cart-cancer-therapy-leukemia-treatment/.

4. https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t-cells

5. Kalos M, et al. T Cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 3: 95ra73 (2011). doi: 10.1126/scitranslmed.3002842

6. Sallusto F, et al. Central memory and effector memory T cell subsets: Function, generation, and maintenance. Annu Rev Immunol 22: 745–763 (2004). doi: 10.1146/annurev.immunol.22.012703.104702