单细胞测序实验的常见问题和避坑指南

【字体: 时间:2022年08月31日 来源:生物通

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  Biocompare最近举办了一个网络研讨会,邀请科学家分享在样本制备、实验设置和数据分析方面的经验和做法。以下是一些大家都关心的问题,看看专家们怎么回答。

单细胞测序技术在2013年被评为“年度方法”,自那时起,技术在不断创新,应用范围也在不断扩大,进一步吸引了人们的兴趣。Biocompare最近举办了一个网络研讨会,邀请科学家分享在样本制备、实验设置和数据分析方面的经验和做法。以下是一些大家都关心的问题,看看专家们怎么回答。

我该使用哪种单细胞测序技术?

德克萨斯大学MD安德森癌症中心的Maria Monberg认为:“在确定单细胞测序的确能够回答你手头上的生物学问题后,你需要弄清楚应该使用哪种类型的单细胞分析,以及如何分析获得的数据。弄清正确的研究设计以及如何分析数据至关重要。”

她认为,这需要考虑到您手头的预算、人员和设备等方面的资源。在开始单细胞测序实验之前,还需要了解质控(QC)方面的要求,因为这些实验往往成本高昂且费时费力。“有些人认为单细胞实验是一种钓鱼工具,但它也可以用来分析和验证假说,”Monberg说。

是否需要互补技术来验证单细胞数据?

单细胞测序通常指的是RNA测序,但单细胞分析不仅限于此,还有许多其他层面的分析,例如测定DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性、空间映射等。“你在单细胞RNA测序水平上发现了一些东西,并不意味着它在其他调控水平上也适用,”Monberg谈道。“因此,你需要一些二级或三级数据集来验证这些基于RNA的结果。”

她自己则使用单细胞RNA测序和多重免疫荧光(mIF),在空间上关联RNA和蛋白水平的结果。“对于我的一些实验,我在同一细胞群上使用不同的解离方案,然后开展单细胞RNA测序,并用分离出的细胞核进行ATAC测序。之后,我会合并不同的数据集,从而对这些测序实验进行正交验证。”

Harm Wessels博士是纽约大学基因组学和系统生物学中心的博士后研究员,师从Neville Sanjana博士和Rahul Satija博士。他在功能基因组学研究中使用CRISPR混合筛选和单细胞RNA测序,以实现高内涵的表型分析。“单细胞测序有助于捕获对某种表型有贡献的细胞。”他们实验室近日开发出一种称为CaRPool-Seq的方法,利用靶向RNA的CRISPR/Cas13d系统实现高效的组合扰动以及多模式的单细胞分析。

如何处理富有挑战性的样本?

Monberg研究的是胰腺癌样本,这种样本是出了名的存活率低,从人体中取出后会自动消化。“尽管是具有挑战性的样本,但精心选择的样本和制备过程的优化也会明显影响数据质量,”她说。样本制备方案也会存在差异,具体取决于样本是来源于新鲜组织、冷冻组织、类器官、细胞系还是动物模型。

一些快速冷冻或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本不能用于单细胞测序实验,或者必须修改实验方案。因此,您需要了解样本的来源和存储状况,这对于实验计划和下游分析至关重要。“我们所做的研究表明,快速冷冻样本的数据质量远低于新鲜组织,”Monberg谈道。“使用多个重复样本也许能解决其中一些质量不佳的问题。”

斯坦福大学医学院的Francisco Galdos认为,使用少量样本进行试点实验可节省成本。“很多时候,人们做得太多,做得太早。在转向更复杂的实验设计之前,需要熟悉你正在使用的技术和方案,”他说。“样本制备所花的时间往往比细胞捕获更长。”标记不合适、交叉污染、染色不足、洗涤不够或未使用物种特异性的抗体,都可能导致结果不准确。

实验需要多少个细胞和重复?

根据Monberg的说法,如果细胞的生存状态良好且样本制备方案经过优化,您的样本中只需要有2000-7000个细胞以及4-6个文库,就可以开展简单的单细胞测序实验。“你还需要了解产生‘可用的’数据所需的最低测序深度。”

Wessels博士在每个泳道中使用约20,000个细胞,每个基因扰动使用100个细胞。因此,如果您要扰动200个基因,每个基因有3-4条单链向导RNA,这个数量基本上就够了。他们的实验室网站上有一个计算器,可用来估算测序成本。

数据中是否存在批次效应?

在理想情况下,所有实验应同时进行,使用相同的试剂,以相同的方式处理。独立分析样本会增加分析的可变性。“对独立样本进行测序可能会非常昂贵,每次运行的成本大约在2000-5000美元之间,”Galdos说。样本处理和制备过程中可能存在与操作和人员相关的变化,并导致更高的技术噪声。

Galdos提醒说,您必须考虑批次效应的来源。“不同的细胞系或个体会产生批次效应,这无法避免。”不过,他认为尽管混样分析可最大限度减少批次效应,但它无法避免样本固有的差异。因此,如果您正在运行时间进程实验,最好将一个人不同时间点的样本混合起来,因为您无法避免不同个体的批次效应。

正如Monberg所说,您不可能设计出完美的单细胞实验。然而,了解容易掉坑的地方,并利用样本制备以及分析工具和生物信息学算法的进步,您当然可以最大限度地减少错误。

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