MERFISH在小鼠初级运动皮层细胞类型特异性Isoform检测中的应用

全长SMART-seq单细胞RNA测序可以用来检测异构体分辨率的基因表达，使得鉴定不同细胞类型的特异性异构体标记成为可能。结合MERFISH空间转录组研究技术以及10x单细胞测序技术，可以推断不同细胞类型的空间分辨异构体表达。A. Sina Booeshaghi及其团队在2021年发表在Nature上的一项研究中，用 SMART-seq分析6,160个小鼠初级运动皮质细胞、用 MERFISH分析280,327个细胞以及用10x单细胞测序技术分析94,162个细胞，三种技术结合起来进行综合分析，发现了细胞类型中Isoform特异性的例子，包括基因水平分析容易被掩盖的Isoform在细胞类型之间转变的例子以及及转录调控的例子。MERFISH、SMART-seq以及10x单细胞测序技术的综合运用提供了小鼠初级运动皮层空间转录综合图谱，有助于细化细胞类型的定义，这比其中任何一种技术的单一运用都更加先进。

为了利用不同平台的互补优势，作者将SMART-seq检测到的isoform与10x Chromium 定义的细胞类型联系起来，并将这些信息与MERFISH获得的空间转录组测量结果合并起来(图1)。除了揭示MOp（小鼠初级运动皮质）中广泛的异构体多样性和细胞类型特异性之外，还发现了MOp中先前遗漏的一些细胞亚型。

图1 使用多平台进行RNA检测

对多平台检测得到的数据进行关联分析和汇总。利用BICCN consortium（大脑全细胞数据库联盟）的聚类方法生成三个层次的单元: class，subclasses和cluster。利用SMART-Seq对测序的6160个单细胞进行t-SNE分析并鉴定到星形胶质细胞、皮质丘脑细胞、 内皮细胞、非神经元细胞 、端脑内侧束细胞、锥体束细胞、平滑肌细胞、脑膜细胞等细胞类型。图2C显示的是谷氨酸能类细胞所特有的一个基因异构体的例子：小提琴图表明Oxr1基因和其Oxr1-204 isoform在谷氨酸能类细胞和GABA类细胞中的分布，该基因的表达没有差异，而isoform的表达是差异化的。同样，在谷氨酸能细胞亚类中，Snap基因在细胞亚型水平上没有差异表达，但其Snap25-202  isoform的表达是差异化的。

图2 Isoform特异性分析

由于所需探针的数量和长度，MERFISH目前不太适合直接检测基因的不同isoform（除非不同的isoform之间有900nt独立的序列差异)，然而可以通过外推SMART-seq isoform定量结果的方法来完善基因水平的空间分析，以产生isoform水平的数据结果。图3中的小提琴图表明不同基因和其isoform在不同细胞中的分布,不同形状表明每种基因表达的isoform的不同比例。

图3 Mop中异构体空间分布图

利用MERFISH技术，可以可视化的呈现MOp中不同细胞类型的空间定位。图4展示的是MERFISH测定到的64张MOp切片上的所有subclass中的细胞空间位置。

图4 MOp中不同细胞类型的空间定位

不仅如此，结合MERFISH技术，还可以可视化的分析isoform的表达梯度。图5是由MERFISH测定的小鼠初级运动皮质的代表性切片，其中每个点(黑色)表示来自相应subclass的细胞的位置。红点表示这些细胞的质心的位置，从质心到切片边界的距离由红线表示。通过火山图分析，将小鼠初级运动皮质深度差异表达的一组isoform与其空间表达定位结合分析，可以看到例如Tubb2a-201 isoform的表达随着运动皮层的深度增加而增加。

图5 MERFISH分析isoform的表达梯度

• 结论 •

为了利用不同平台的互补优势，作者将 SMART-seq 对同源异构体的鉴定与单细胞测序进行细胞类型分类的结果联系起来，并将这些信息与MERFISH获得的空间转录组结果合并，扩展了单细胞数据库的概念，绘制出了MOp基因异构体的单细胞空间图谱。本研究结果表明，异构体水平的表达可以帮助细化小鼠MOp中的细胞类型，并且优于使用基因水平的表达进行的评估分类 。此方法是开放的，可重复的，易于使用，构成了一个利用多种技术平台相结合得到的综合数据进行有效分析的更好的工作流程。

参考文献：
A. Sina Booeshaghi , Zizhen Yao et al. Isoform cell-type specificity in the mouse primary motor cortex. Nature | Vol 598 | 7 October 2021 | 195

MERFISH技术

2021年，世界上第一款商品化的多重FISH超分辨率成像分析系统MERSCOPE™在美国发布。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE™ 可在1天内对1cm²的组织进行超分辨成像，分辨率≤100纳米，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间基因组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™ MERFISH超分辨荧光显微成像分析系统在中国的总代理。负责该系统的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。戳下图获得更多一手资料吧~

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