自动化、高灵敏度的CRISPR基因编辑质控方案

【字体: 时间:2022年08月05日 来源:基因有限公司

编辑推荐:

  今天的文章将向大家介绍Aglient毛细管电泳技术在CRISPR 基因编辑中对gRNA和ssDNA(单链DNA)模板的质控以及编辑发生后HDR效率评估的应用。

CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas9基因编辑技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一,成为当今主流的基因编辑系统。CRISPR-Cas9技术包含两种重要的成分,一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,而另一种则是具有导向功能的gRNA (guide RNA)。gRNA与Cas9蛋白形成复合物,靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生双链断裂(DSB),引发细胞内部的DNA修复机制(DNA repair)。真核细胞同时存在着HDR(同源重组修复)和NHEJ(非同源末端连接)。

NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制,用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。对比NHEJ修复途径,HDR 途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中,需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板, HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点,从而实现基因的敲入。


图1. An overview of CRISPR/Cas 9 mediated genome editing(doi: 10.3390/pharmaceutics13101649)

今天的文章将向大家介绍Aglient毛细管电泳技术在CRISPR 基因编辑中对gRNA和ssDNA(单链DNA)模板的质控以及编辑发生后HDR效率评估的应用。

gRNA质控

gRNA依赖于工程DNA模板的体外转录,利用这一过程合成gRNA可以产生足够的材料进行多次转染。然而,多次冻融、不当处理或污染会使gRNA降解,妨碍高效的基因编辑。所以gRNA的质控是CRISPR基因编辑过程中的重要环节。以下比较了传统琼脂糖凝胶电泳和5200 片段分析仪,对gRNA降解程度和片段大小的检测。


图2.用Agilent 5200 片段分析仪,Agilent HS RNA kit (15 nt) 分别分析不加热、热变性(70℃10分钟)或(90℃30分钟)的sgRNA样品(LP:Linear peak,SSP:secondary structure peak,DG:degradation)


图3.琼脂糖凝胶电泳分离在90℃下降解0、30、60、90、120分钟的gRNA #7。

根据毛细管电泳的结果可以看出,在没有热变性的情况下,sgRNA 分离为147 nt的线性主峰(LP)和543 nt的二级结构峰(SSP)(图2A)。经过热变性的RNA分子其内部二级结构减少,从图中也可以看出二级结构峰下降。与此同时,毛细管电泳能以优异的灵敏度检出70℃变性10min和90℃变性 30 min条件下的轻微gRNA降解(DG)(图2 B、C)。  

通过凝胶电泳分离降解的sgRNA ,可以看到两个明显分离的主峰和二级结构峰,但受限于由于传统凝胶电泳的分辨率,没有观察到90℃热变性30分钟后的gRNA的降解,只在经历90℃热变性60和90分钟的泳道中我们才能观察到RNA降解导致的条带拖尾现象(图3)。并且传统凝胶电泳的低分辨率只能估计条带的大小和降解程度,而5200 片段分析仪易于片段可视化和自动分析。

通过以上实验看到琼脂糖凝胶电泳在分析gRNA的质量时,只能确定gRNA是否被大程度地降解,但其分辨率和灵敏度不足,无法检测轻度的RNA降解。此外,RNA琼脂糖凝胶还需要使用甲醛和DEPC等有害物质,需要多个人工操作步骤,给实验人员带来健康风险。Agilent 5200 片段分析仪实现gRNA质控步骤的自动化,无需使用危险的变性剂,同时提供更高的分辨率,能够检测出轻微的RNA降解。

HRD ssDNA模板质控

研究发现,CRISPR/Cas  HDR介导的基因敲入过程中,ssDNA模板相较于dsDNA(双链DNA)模板能够大大增加HDR效率。ssDNA模板获取方法:用带5 '磷酸化和不带5 '磷酸化的引物PCR扩增dsDNA模板,再使用链选择性核酸酶处理PCR产物生成ssDNA。ssDNA模板生成需要质量控制步骤,以确保从dsDNA到ssDNA的完全转换。

(1)完全消化的dsDNA鉴定

下图展示利用Agilent 5200毛细管电泳和传统琼脂糖电泳分析未消化dsDNA和选择性核酸酶(TaKaRa, #632644)37℃消化5分钟的电泳结果:两种方法均明确鉴定出预期大小为1000 bp的dsDNA PCR产物和更小尺寸的ssDNA,且均表明该dsDNA被消化为ssDNA终产物,适合用于同源性指导修复。5200 片段分析仪高灵敏度特性使其仍能检测到少量未消化的dsDNA(图4A;蓝色印迹)。



图4. (A)用Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒在 Agilent 5200 片段分析仪上分析起始dsDNA PCR片段(黑色)和消解后的ssDNA(蓝色)终产物,(LM = lower marker; UM = upper marker)。(B) GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳。

(2)不完全消化的dsDNA鉴定

下图展示利用酶消化1.5分钟来模拟未完全消化的效果,5200 片段分析仪在两次消化中都清楚地识别出未消化的dsDNA和ssDNA终产物(图5A和B)。然而,通过琼脂糖凝胶电泳分离(ssDNA 3和4),显示片段的尺寸略小于起始的dsDNA PCR产物(dsDNA 3和4)(图2C)。因此,很难确定是否发生了消化,以及最终产物是含有ssDNA、dsDNA,还是dsDNA和ssDNA的组合。



图5. 将dsDNA PCR产物部分消化为ssDNA终产物(A) #3 (B) #4。用Agilent 5200 片段分析仪和Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒对两者进行分析(LM = lower marker; UM = upper marker)。(C)琼脂糖凝胶电泳分析#3和#4 DNA样品。

5200 片段分析仪提供快速、敏感的长ssDNA终产物分析,用于CRISPR/Cas HDR介导的基因编辑。与琼脂糖凝胶电泳相比,5200 片段分析仪具有更高的分辨率和灵敏度,可以更清晰地了解样品组成和少量剩余未消化的dsDNA,这些有助于研究人员决定样本是否适合下游应用。
 
限制性内切酶评估CRISPR HRD效率

现在有许多研究者使用HDR修复方式进行基因的敲除,HDR引入的同源片段中含有特定的限制性酶切位点,这种方法既能破坏开放阅读框实现基因敲除,又能不经过单克隆生长和挑选步骤,在混合细胞样本中建立快速量化编辑效率的体系:

1 通过敲除位点两端的特异性引物,PCR扩增编辑位点;
2 使用限制性内切酶处理扩增子,只有包含HDR事件的扩增子才会被酶切;
3 基因编辑效率等于HDR事件百分数即酶切效率。

理论上的HDR效率计算公式如下:

分别用5200片段分析仪(Agilent CRISPR Discovery凝胶试剂盒)和2%琼脂糖凝胶电泳对酶切后的片段进行分析。

结果显示30个PCR循环下能有效检出酶切后的片段和同源双链分子,但是还发现了PCR扩增过程中产生了高比例的异源双链分子,这会影响内切酶的可及性,使得对HDR事件的评估不准确。因此将PCR循环数减少为15来改善这一情况,得益于毛细管电泳的分辨率和灵敏度,仍能有效检出被酶切的片段、同源双链分子以及极少量的异源双链分子,增加了HDR事件量化的准确性。安捷伦片段分析仪甚至能够有效检出低至6%的HDR事件。



图7. 已知pHDR比例为40%的模板,30(左)和15(右)个PCR循环扩增后酶切的毛细管电泳结果

而琼脂糖电泳受限于灵敏度和分辨率,即使30个PCR循环扩增后,只有含40%的pHDR模板(含有酶切位点的模板)才能被检测到酶切片段,并且无法区分同源和异源双链(图8)。


图8. 已知pHDR比例(分别为6%、12%、25%和40%)的模板30个PCR循环扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果

综上,Agilent 5200 片段分析仪能在混合细胞样品中进行基因分型评估HDR的比率,ProSize软件上的CRISPR插件自动计算酶切百分比,从而快速量化编辑效率。5200 片段分析仪系统的高分辨率使同源和异源双链分离,有助于优化PCR条件,限制混合模板PCR过程中异源双链的形成。此外,与琼脂糖凝胶电泳分析相比,5200 片段分析仪系统的高灵敏度,可以检测低水平的HDR事件,减少了筛选样品的时间。       

Agilent Fragment analyzer 基于阵列式毛细管电泳的原理,为DNA和RNA的定性或定量分析提供简便的无需值守的自动化流程,可自动完成灌胶、上样、电泳和分析,可获得核酸片段分布、分子量、浓度、片段含量百分比等信息。

除了CRISPR质控应用,Agilent毛细管片段分析仪还被广泛应用于二代测序或三代测序过程中基因组和文库的质控、SSR分子标记分析、常规DNA/RNA或扩增产物片段大分析、mRNA质控分析、质粒DNA分析、生物制品宿主DNA残留长度质控等领域,具有广泛的适应性。

基因有限公司作为Agilent自动化电泳产品线的中国区代理商,为您提供完整的CRISPR基因编辑质控解决方案。欲了解详情,请扫描左侧二维码,将有技术人员一对一为你答疑解惑~

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号