简介 白癜风是最常见的获得性皮肤色素脱失症，影响世界人口的0.5%至1%( 1). 白癜风患者黑素细胞丢失的发病机制复杂，涉及多种机制的共同作用，包括遗传、免疫介导、内在、氧化和环境因素( 1– 三). 虽然黑素细胞的丢失最终是由细胞毒性CD8引起的 + 细胞、每个相关因子的独特作用以及引发一系列导致自身免疫介导的黑素细胞消失的事件序列的启动原因尚待强调。
多年来，大多数关于白癜风的研究试图典型化疾病相关的功能特征，主要是病变和周围皮肤。 然而，越来越多的证据表明白癜风不仅仅局限于黑素细胞，而是涉及整个皮肤，甚至是色素沉着的区域( 4). 与这些评论一致，在正常皮肤成纤维细胞中，衰老相关的功能改变能够影响黑素细胞的正确定位和消失( 5). 诱导自噬作为一种对内在代谢脆弱性的适应性/代偿反应，在非损伤性黑色素细胞和成纤维细胞中也得到了证实( 6). 炎症过程的产生导致对黑素细胞的自身免疫反应的激活，可能与有规律着色的皮肤细胞的遗传性功能缺陷有关。 因此，我们研究了白癜风患者正常外观皮肤的表皮特征，以探索作为免疫激活触发器的内在损伤的潜在存在。
在皮肤细胞中，角质形成细胞在维持皮肤内环境平衡中起着至关重要的作用，因为角质形成细胞在表皮层形成适当的分层结构以保证皮肤屏障的构成。 当基底增殖的角质形成细胞通过表皮向上移动时，它们会经历形态和功能的改变，形成分化的死细胞，角质细胞。 分化程序通过早期（如角蛋白1和10）和晚期（如总苞素、丝状蛋白和萝莉苷）结构蛋白的顺序表达进行，其组装最终形成角质化的包膜( 7). 角质细胞包埋在脂质基质中，脂质基质主要由神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸（ffa）组成，这些脂肪酸在角质层（SC）中的适当分布由酶的协同作用合成和加工而成( 8, 9).
在白癜风患者的皮损中，发现角质形成细胞受到许多干扰，包括与分化和角质化有关的基因以及表皮厚度和结构的改变( 10, 11). 此外，还记录了胶带剥离后出现的异常屏障功能和延迟恢复( 12). 早期报告还描述了正常色素沉着区角质形成细胞变性和表皮结构改变( 13)最近的研究报告了非病变表皮的棘皮病( 14, 15). 角质形成细胞除了构成皮肤屏障的主要结构成分外，还可以通过释放和响应多种炎症介质和生长因子来感知周围微环境中的生理和病理变化( 16, 17). 不恰当的组装以及对皮肤屏障本身的外部损伤，可能诱导角质形成细胞产生炎症信使，并激活与免疫皮肤成分的交互作用，从而创造一个促炎环境。 角质形成细胞改变、屏障破坏和炎症之间的联系已被广泛接受于几种慢性炎症性皮肤病中，其中特应性皮炎和银屑病就是其中的一个例子( 18– 20). 角质形成细胞现在也被认为是白癜风的关键因素。 角质形成细胞一旦受到应激性事件或炎症介质的刺激，如活性氧（ROS）或干扰素-γ（IFN-γ），即是趋化因子C-X-C基序配体（CXCL）9、CXCL10和CXCL16的主要来源，这些趋化因子参与并激活细胞毒性CD8 + 针对黑素细胞的T细胞( 21, 22). 表皮CXCL10和活化CD8的阳性表达 + 在非病变区域观察到T细胞，这表明在正常色素沉着的皮肤中已经存在亚临床炎症活动( 23, 24).
白癜风患者皮肤角质形成细胞分化和SC脂质谱的改变及其作为启动黑素细胞免疫反应的触发因素尚未被研究。 因此，我们的目的是探讨白癜风患者皮肤的分化程序和脂质屏障组成。 我们评估了原代培养的白癜风角质形成细胞和SC样本，我们报告角质形成细胞显示出分化和分层的改变。 使用脂质体分析方法，我们发现白癜风患者SC的脂质成分不平衡。 我们还观察到，白癜风患者角质形成细胞（VHKs）比正常人角质形成细胞（NHKs）分泌更多的炎症介质，并且在轻度机械应激后，这种分泌进一步增加，表明白癜风细胞的免疫激活更大。 因此，我们的研究结果表明，正常白癜风皮肤中角质形成细胞相关的失调是轻度压力暴露后局部炎症发生的基础。 随后天然免疫的激活促进黑素细胞抗原呈递和诱导针对黑素细胞的适应性免疫反应。 对白癜风非病变表皮的特征，尤其是角质形成细胞增殖、分化和脂质组成的改变的认识，为临床表现的出现提供了可能的致病因素，并为有效治疗提供了潜在的创新目标。
结果 非损伤性白癜风角质形成细胞表现出形态和增殖的改变 角质形成细胞增殖和分化之间的协调平衡控制着表皮的正确排列和完整性。 因此，我们首先评估了从非损伤皮肤收集的VHKs原代培养物的形态和生长潜力，并将其与对照组NHKs进行了比较。 显微镜下分析显示，有几个增大的细胞彼此不粘附，而NHKs则表现为小的多边形细胞，生长在均匀的菌落中( 图1A). 细胞面积的定量分析证实VHKs的平均大小明显大于NHKs( 图1A; * P <0.05）。 与NHKs相比，VHKs显示出表达增殖标记Ki67的细胞百分比的生长率显著降低( 图1B; ** P <0.01）。 因此，数据显示VHK比NHK更大，细胞间连接更少，增殖能力更低。
图1 白癜风角质形成细胞的形态、增殖和分化相关特征。
( A )NHKs和VHKs的形态学分析及细胞面积（μm）的测量 2 )（至少1000个来自NHKs=6和VHKs=6的细胞）。 结果表示为每个样本的面积/单元的平均值。 ( B )Ki67阳性NHKs和VHKs的免疫荧光和定量分析。 箭头指向Ki67阴性的角质形成细胞（至少1800个来自NHKs=5和VHKs=5的细胞）。 结果表示为每个样本的Ki67阳性细胞/总细胞（%）的平均值。 ( C )在低钙和高钙培养基中生长的NHKs和VHKs的形态 n =7和VHK n =7）。 ( D )K10和总苞素对NHKs的免疫荧光研究( n =3）和VHKs( n =3）保持在低钙和高钙的培养基中。 ( E )低钙和高钙条件下NHKs和VHKs上K10和总苞素的Western印迹及相应的密度分析。 显示了一个具有代表性的印迹。 ( F )神经酰胺相关途径相关酶和 船边交货 在NHK和VHK上( n =在低钙和高钙条件下，每组至少3个。 值根据表达式进行规范化 GAPDH公司 . * P <0.05** P <0.01。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。 刻度条，50μm。
与皮肤屏障脂质生物合成和代谢相关的分化相关蛋白和酶在非病变白癜风角质形成细胞中被解除调控 在评估了与细胞形态和生长潜能相关的特征后，我们分析了VHKs的分化承诺。 钙在体内外角质形成细胞分化中起着重要的调节作用( 25, 26). 在低钙（<0.07mm）培养基中培养的角质形成细胞增殖类似于体内基底细胞的表型。 当钙的补充量增加到1.2到1.8毫米时，细胞开始分化，这是通过细胞形态的改变和特定分化标志物的表达来评估的( 26). 因此，为了遵循分化过程，我们将VHKs和NHKs暴露在高钙（1.8 mM）浓度下。
尽管NHKs在高钙浓度下发生了典型的分化相关的形态学变化，表现为细长、紧密排列和聚集的外观，但这些变化在VHKs中不太明显( 图1C). 免疫荧光法检测早期分化标志物角蛋白10（K10）和晚期分化标志物总苞素； 与NHKs相比，VHKs不能上调这两种蛋白对钙的反应( 图1D). 定量Western印迹分析证实VHKs对K10和总苞素的诱导作用弱于NHKs( 图1E). 为了更准确地评估角质形成细胞的分化，我们接下来测定了对生成SC细胞间脂质基质的重要酶的mRNA表达水平。特别是，我们重点分析了编码神经酰胺（CER）相关途径酶的基因。 极长链脂肪酸蛋白4的酶伸长( ELOVL4型 )，神经酰胺合酶( 核证减排量 )3，花生四烯酸12脂氧合酶，12R型( 阿洛克斯12b )，谷氨酰胺转胺酶1( TGM1型 )在暴露于高钙介质的VHKs中没有上调，但在类似条件下NHKs中却显著诱导( 图1F; * P <0.05和** P <0.01）。 钙增加后，patatin样磷脂酶结构域含有1( PNPLA1 )，花生四烯酸脂氧合酶3( 阿洛克斯3 )，以及含有4个的类NIPA结构域( 尼帕尔4 )酶在对照细胞和白癜风细胞中均未被诱导。 脂肪酸合成酶（FAS）在NHKs和VHKs之间的表达没有差异( 图1F). 因此，数据显示，随着钙浓度的升高，白癜风角质形成细胞不能上调CER相关途径中大多数酶的表达，而对照组和白癜风角质形成细胞之间没有检测到FAS的差异，这表明神经酰胺的生物合成有特异性的放松。 为了证实VHKs中参与神经酰胺生物合成的酶的表达改变有效地导致神经酰胺含量的降低，我们通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）评估了增加钙补充后NHKs和VHKs中神经酰胺的分布。 我们发现NHKs能够显著提高与VLC（C20–C25）和超长链（ULC）（C26–C28）脂肪酸相连的神经酰胺的产量，这些脂肪酸由CERS3合成，并参与分化过程。 另一方面，VHKs不能增加大多数脂肪酸链长的神经酰胺的含量 ≥ C20（图S1，A至F* P <0.05）。
在钙升高的同时，我们还用细胞密度作为一种额外的体外模型来刺激角质形成细胞的分化( 25, 27). 细胞在培养基中维持4、7、10和14天，并且进行性细胞密度促进了NHK的形态变化，导致在长时间培养中从单层向多层转变（图S2A）。 同时，VHK并没有产生广泛的多层结构（图S2A）。 在第7、10和14天层积减少的同时，VHK培养物中K10和总苞素蛋白的表达低于对照细胞培养物（图S2B）。 采用切趾体系统对K10和总苞素荧光信号进行光学切片和三维重建； 这些分析证实了培养14天后，与NHK相比，VHK的多层病灶减少，分化标记的表达较弱（图S2C）。 平行免疫荧光分析显示VHK患者的ELOVL4、CERS3和TGM1水平低于NHK（图S2D）。 与钙升高后观察到的情况类似，VHKs中细胞密度介导的分化受到损害，表明白癜风皮肤的分化和分层过程受到损害。
非病变性白癜风角质形成细胞显示受损的细胞-细胞连接和肌动蛋白细胞骨架重塑 一旦它们开始分化，角质形成细胞组织细胞间的接触，这对正确的分层和皮肤完整性至关重要。 体外钙浓度的升高和细胞融合刺激细胞间连接的形成和细胞在多层膜中的组装。 As-attens连接是调节角质形成细胞分层的关键细胞-细胞相互作用( 28)我们分析了主要成分E-钙粘蛋白的表达和分布。 在高钙或高密度诱导分化的细胞中，E-cadherin在NHKs细胞-细胞边界有规则的组织，但在VHKs中分布不均匀( 图2，A和B). 双重免疫荧光染色证实在包被蛋白表达的分层NHKs中有一个规则的、连续的E-cadherin信号，而VHKs中E-cadherin和involucrin的免疫染色信号较弱( 图2C). 接下来，我们评估了细胞分化后肌动蛋白的细胞骨架重组，这是有利于角质形成细胞进行适当分层所需的细胞-细胞相互作用和粘附的另一个关键步骤。 在低钙条件下生长的NHKs和VHKs都有一些应力纤维（由phalloidin表示），但缺乏外周肌动蛋白重塑( 图2D). 随着钙的增加，VHKs的细胞骨架重组受损且不完整，而肌动蛋白丝在每个NHK的外围重新排列成规则的蜂窝状( 图2D). 因此，白癜风角质形成细胞在细胞-细胞接触中表现出缺陷，这是皮肤适当分层和完整性的决定性因素。
图2 白癜风角质形成细胞分化过程中E-钙粘蛋白的表达和细胞骨架重组。
( A )E-钙粘蛋白在NHKs上表达的免疫荧光研究( n =3）和VHKs( n =3）在高钙浓度（1.8 mM）的培养基中生长。 框内区域表示选定虚线框的放大视图。 ( B )E-钙粘蛋白在长期培养的nhk上表达的免疫荧光研究( n =3）和VHKs( n =3）。 框内区域表示选定虚线框的放大视图。 ( C )高钙条件下生长48h的NHKs和VHKs上E-cadherin和involucrin表达的双重免疫荧光研究。 ( D )NHKs的TRITC-phalloidin染色( n =3）和VHKs( n =3）在低钙和高钙环境中培养48小时。 细胞核用DAPI复染。 刻度条，50μm。
非病变性白癜风角质形成细胞能量代谢受损 为了确定在VHK分化和分层过程中观察到的缺陷是否依赖于受损的细胞能量和线粒体代谢途径，如先前在白癜风黑素细胞中所证实的那样( 29)我们检测了NHKs和VHKs中三磷酸腺苷（ATP）的水平，并观察到白癜风角质形成细胞内ATP的低生成( 图3A; ** P <0.01）。 作为线粒体的活性，因此，ATP的产生受到核编码的线粒体转录因子A（TFAM）的强烈影响( 30– 32)我们接下来研究了TFAM在白癜风角质形成细胞中的表达水平。 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示VHKs的基因表达明显低于NHKs( 图3B; * P <0.05）。 这种降低在蛋白质水平上也很明显，免疫荧光结合染色强度图像分析检测到( 图3C; ** P <0.01）。 在观察到VHKs中ATP和TFAM降低的基础上，我们接下来分析了无氧糖酵解代谢酶的基因表达水平，以评估糖酵解是否作为能量缺陷的代偿途径而被诱导。 VHKs显示编码关键厌氧糖酵解酶基因的mRNA表达增加( 33)己糖激酶( 香港 )，磷酸果糖激酶( PFK公司 )，丙酮酸脱氢酶( PDHK1 )提示激活细胞内替代代谢过程以抵消低ATP浓度( 图3D; * P <0.05和** P <0.01）。
图3 白癜风角质形成细胞的代谢行为。
( A )NHKs的ATP测定( n =4）和VHKs( n =5）(** P <0.01）。 ( B )的mRNA转录 TFAM公司 在NHKs( n =7）和VHKs( n =8）(* P <0.05）。 ( C )NHKs和VHKs中TFAM的免疫荧光和信号强度测量（至少700个来自NHKs=4和VHKs=4的细胞）。 结果表示为每个样品的强度平均值/细胞** P <0.01。比例尺，20μm。 ( D )糖酵解酶的mRNA转录本 香港 , PDHK1 ，和 PFK公司 在NHKs( n =5）和VHKs( n =8）(* P <0.05** P <0.01）。 ( E )在含有低或高钙浓度的DNP存在下，对Ker-CT细胞裂解物进行TFAM、K10和总苞素的Western印迹。 显示了具有代表性的印迹。
细胞内ATP生成的抑制已被报道影响角质形成细胞的分化，这反映在当细胞内ATP合成受阻时，分化标志物总苞素的表达减少( 34). 因此，我们下一步直接质问受损的能量生产和缺陷分化之间的联系。 为此，我们使用永生化的人角质形成细胞系kerct，因为这些细胞显示出正常的分化潜能，通过基底上分化标记物的表达和形成分化上皮的能力来评估( 35– 37). 我们将细胞暴露在有或没有线粒体解偶联剂2,4-二硝基酚（DNP）的情况下的钙，这改变了线粒体的质子梯度，阻碍了细胞ATP的产生( 38, 39). 以K10和总苞素蛋白水平分别作为早期和晚期分化标记物，评价了该化合物对TFAM表达和分化过程的影响( 图3E). 在高钙条件下，与低钙细胞相比，kerct细胞表现出TFAM、K10和总苞素的表达水平增加，而在DNP存在的情况下，与未经处理的细胞相比，这三种蛋白的表达呈剂量依赖性降低( 图3E). 因此，这些发现提示能量缺陷可能是白癜风角质形成细胞正常分化和分层能力受损的原因。
非皮损性白癜风皮肤角质细胞稀少，表达角质结蛋白的分布改变 完整SC的构成严格依赖于角质形成细胞的适当分化形成角质细胞。 因为我们的结果显示白癜风角质形成细胞分化受损，我们想知道这种缺陷是否也反映在角质细胞的改变中。 用胶带剥离法采集对照组皮肤和白癜风患者非病变皮肤的SC标本。 用图像分析法测量角质细胞覆盖的剥离带面积，结果表明，非病变白癜风皮肤样本中角质化细胞数量少于对照皮肤样本，而对照皮肤中角质细胞丰富且堆积( 图4A; * P <0.05）。 细胞数量的减少与总蛋白含量的结果是一致的，总蛋白质含量是衡量SC凝聚力的一个指标( 40, 41)在白癜风患者中，这一数值明显低于对照组，因此在白癜风患者中表现出较高的凝聚力( 图4B; ** P <0.01）。 角质桥粒是表皮最上层的主要细胞-细胞粘附物( 42); 考虑到非病变性白癜风皮肤中其他细胞间连接的缺陷，我们还对角质桥粒核心的糖蛋白角质桥蛋白进行了免疫荧光分析( 43). 分析显示细胞边缘呈阳性，对照组偶尔有点状胞浆染色。 在大多数无病变的白癜风标本中，角质结蛋白的反应性较弱，在角质细胞边缘不太突出； 相反，细胞表面弥漫性阳性病灶普遍存在( 图4C). 因此，这些结果强调了非损伤性白癜风角质细胞的改变。
图4 白癜风SC特征。
( A )图像分析测量角质细胞覆盖的D-鳞片面积百分比/总面积（%）（对照组） n =14； 白癜风 n =14）(* P <0.05）。 显示了一个非病变性白癜风和一个对照样品的代表性图像（比例尺，50μm）。 ( B )从对照组采集的SC蛋白质含量( n =49）和白癜风受试者( n =51）(** P <0.01）。 ( C )角结蛋白免疫荧光染色法检测对照组( n =7）和非病变性白癜风( n =7）角质细胞标本。 比例尺，20μm。 ( D )对照组和白癜风患者的FFAs、CH和CHS的热图：显示个体特征和中介数据。 ( E )当考虑控制和白癜风情况时，将残差投影到显著主成分（PC）所跨越的空间后，ffa、CH和CHS的得分图。 ( F )对照组和白癜风受试者的ffa、CH和CHS负荷图。 每个加载杆代表一个脂质组分及其置信区间； 红色和蓝色条分别表示显著[10000次重复的引导，95%的置信区间（CI）]，而没有显著贡献的描述符（对照组 n =49； 白癜风患者 n =51）。
非病变性白癜风SC的脂质成分不平衡 为了保证皮肤屏障的正确完整性，蛋白质和脂质成分形成并密切配合。 因此，我们探讨白癜风角质细胞中检测到的结果是否反映在角质化层脂质成分的变化上。 由于SC的脂质基质主要由神经酰胺（CERs）、ffa、胆固醇（CH）和胆固醇硫酸盐（CHS）组成，因此我们用GC-MS和HPLC-MS分析了正常白癜风和健康对照皮肤SC中的脂质类。 与对照组相比，白癜风组的CH、CHS和ffa普遍增加，如单个样本的热图以及白癜风组和对照组的平均值所示( 图4D). 方差分析（ANOVA）同时成分分析（ASCA）分数图显示白癜风组和对照组之间有明显的分离( 图4E). 主成分分析（PCA）分析表明，白癜风组24种检测分析物中有21种与对照组相比显著升高，而两种ffa（C19:0和C26:0）水平显著降低( 图4F; * P <0.05）。
在这些结果的基础上，我们进一步深化了对特定FFA变化的分析，根据链长来评价其在对照组和白癜风组SC标本中的分布。 尽管两组在长链（LC；C12–C20）（图S3A）和VLC（C21–C25）FFA（图S3B）的百分比上没有显著差异，但白癜风患者SC标本中ULC（C26:0）FFA的百分比明显低于对照组（图S3C* P <0.05）。 此外，白癜风组的SC样本中单不饱和脂肪酸（MUFAs）的百分比明显较高；图S3D* P <0.05）和C18:2脂肪酸（图S3E** P <0.01）。 总的来说，这些结果表明白癜风患者的SC在胆固醇和FFA组成方面表现出不平衡。 为了剖析参与皮肤屏障组装的所有主要类脂的分布，与胆固醇和ffa的评估平行，我们还分析了神经酰胺的组成。 CERs是SC中主要的脂类成分，根据分子结构分为亚类。 最丰富的CER亚类包含两个脂肪酸部分，非羟基[N]和α-羟基[A]部分，与四个鞘氨醇碱基部分之一结合：鞘氨醇[S]、二氢鞘氨醇[DS]、植物鞘氨醇[P]和6-羟基鞘氨醇[H]。 我们使用预定的多反应监测（MRM）技术（表S1）对α-羟基FA-CER（CER[ADS]、CER[AS]、CER[AP]和CER[AH]）和非羟基FA-CER（CER[NDS]、CER[NS]、CER[NP]和CER[NH]）亚类进行了分析（表S1）。 在检测到的CERs中，我们对两组SC样本中最丰富的96个cer进行了对比分析。 来自对照组和白癜风组的SC标本的CER曲线显示在热图中( 图5A). 虽然CER分布的个体间差异很大，但将对照组和白癜风数据分组平均后，两组之间的CER差异模式变得明显( 图5A). 所分析的CER的ASCA评分图显示白癜风组和对照组之间有明显的分离( P <0.01； 图5B). 如负荷图所示，在96个评估的CER中，两个组中有61个处于显著不同的状态（红色条）：白癜风组57个水平较低，4个较高( 图5C; * P <0.05）。 此外，在白癜风SC样本中，我们观察到CER中LC脂肪酸（C22–C28）部分的水平显著降低（表S2）。 这种改变模式可能与CERS活性的降低有关，如角质形成细胞培养中对VLC或ULC脂肪酸（如CERS3）具有高度亲和力( 图1F). 在白癜风患者和对照组之间，CER的鞘氨醇成分的分布也有所不同，白癜风患者标本中大多数鞘氨醇碱基减少，表明CER合成途径发生了变化。 白癜风组所有四个CER增加都含有C18的非循环成分或鞘氨醇基。 欧洲核子研究所（18）S( 18)白癜风组CERs升高最为显著，脂肪酸和鞘氨醇碱中含有C18( P <0.01）； 这一结果可能与观察到的C18 FFA和前体C16 FFA的增加有关（表S2）。 白癜风组所有被评估的CER亚类均呈下降趋势，CER[AP]、CER[AS]、CER[NDS]和CER[NP]的差异具有统计学意义，在两组之间产生了明显的分离( 图5，D和E; * P <0.05）。 此外，我们计算了CER[NP]与其他CER亚类之间的比率，作为皮肤屏障特性的标记( 44). 由于CER[NP]水平显著降低，与对照组相比，白癜风患者的CER[NP]/[NDS]、CER[NP]/[NH]、CER[NP]/[NS]、CER[NP]/[AP]、CER[NP]/[AH]和CER[NP]/[AS]比值显著降低( 图5F; * P <0.05）。
图5 白癜风患者血清中CER的含量。
( A )对照和白癜风CER热图：显示96个最丰富的CER和介导数据的个人概况。 ( B )当考虑控制和白癜风情况时，将残差投影到显著主成分（PC）所跨越的空间后，最丰富的CERs的评分图。 ( C )SCA加载图：每个加载条代表一个神经酰胺及其置信区间； 红色和蓝色条分别表示显著（10000次重复的引导，95%可信区间）和非显著贡献描述符。 ( D )非α-羟基facer和α-羟基facer亚类在考虑对照和白癜风情况时的评分图。 ( E )SCA加载图：每个加载条代表一个神经酰胺子类及其置信区间。 ( F )对照组和白癜风患者SC中CER-NP亚类与其它CER亚类的比值。 所有条形图显示平均值±SD。 Bonferroni校正确定的统计显著性(* P <0.05）标记（对照受试者 n =49； 白癜风患者 n =51）。
以总含量百分比表示的CER比例的ASCA评分图（图S4A）和负荷图（图S4B）显示，对照组和白癜风组之间的分离程度更大。 基于所分析的所有脂类参数的PCA图显示白癜风患者和对照组之间的明显分离，强调白癜风患者表皮脂屏障成分的显著变化（图S4C）。 我们分析了单一脂质成分的变化与白癜风程度评分（VES）测量的疾病状态之间的可能相关性。 SC中的CER、FFA、CH和CHS含量与VES（平均值）无显著相关性 R = ? 0.17，平均 R =0.03， R =0.05，以及 R = ? 分别为0.18）。
随后，我们将分析扩展到病变区域，并选择了另外一组前臂有病变的患者。 PCA证实了非病变区与对照区的差异，而病变区和非病变区表现出相似的表皮脂谱异常( 图6，A和B).
图6 .FFA PCA。
( A )PCA显示对照区和白癜风非病变区（NL）之间有明显的分离。 ( B )PCA显示白癜风皮损（L； n =35）和非损伤性（NL； n =35）区域（对照组 n =49）。
炎症介质在非病变白癜风角质形成细胞中上调 角质形成细胞分化、屏障组成和功能的改变与几种皮肤病的免疫反应失调有关( 16– 20). 此外，皮肤屏障缺陷会削弱皮肤适当抵抗外伤的能力，从而破坏组织的稳态，并可能引发局部炎症并使其长期存在。 在这种情况下，角质形成细胞可以触发Koebner现象，在这种现象中，轻微和反复的机械损伤会加重炎症性皮肤病，包括白癜风( 45, 46). 因此，基于白癜风患者表皮分化和脂质成分的不平衡，我们评估了炎症介质在VHKs中的表达。 我们重点分析趋化因子CXCL10，因为它参与T细胞向皮肤的募集和黑素细胞凋亡( 21, 47)白细胞介素-1β（白细胞介素-1β）和白细胞介素-6（白细胞介素-1β）在白癜风炎症网络中的作用( 48). qRT-PCR分析显示显著高于对照组 白细胞介素1 Β (** P <0.01）和 CXCL10型 (* P <0.05）VHKs中的基因表达高于NHKs，而在VHKs中没有观察到显著差异 白细胞介素6 ( 图7A). 在蛋白质水平上，培养上清液的酶联免疫吸附试验（ELISA）分析显示，在48小时和72小时，CXCL10的产量增加(** P <0.01； 图7B)72小时后IL-1β的表达量也随之增加(** P <0.01； 图7C)在VHK文化中与NHK文化相比。 接下来，我们评估了划痕损伤细胞单层中趋化因子和细胞因子的释放，这是一种科布纳现象的体外模型( 49). 从伤后24小时和48小时开始，VHK组的CXCL10释放逐渐增加，在这两个时间点，VHK组培养上清液中的CXCL10水平显著高于NHK组( 图7B; ** P <0.01）。 与NHKs相比，VHKs在24小时和48h时的IL-1β生成量也有所增加( 图7C; ** P <0.01）。 因此， 白癜风角质形成细胞中炎性介质的高表达和释放以及Koebner现象擦伤模型后的进一步增加，提示角质形成细胞分化和皮肤屏障脂质组成的改变可能是局部炎症反应发生的启动决定因素 负责激活黑素细胞的免疫反应。 为了研究观察到的角质形成细胞功能障碍是否归因于先前存在的炎症环境，我们用重组CXCL10治疗正常的原代角质形成细胞，并分析趋化因子对角质形成细胞分化的影响。 为此，我们首先测定了NHKs和VHKs上CXCL10受体CXCR3的mRNA表达水平，qRT-PCR分析显示CXCR3基因阳性表达，而对照组和白癜风角质形成细胞之间没有差异( 图7D). 接下来，我们用MTT法评估了在增加CXCL10浓度的情况下角质形成细胞的活性，与未经处理的细胞相比，在分析的任何剂量下均未观察到明显的改变( 图7E). 通过westernblot和免疫荧光分析检测K10和总苞蛋白水平，探讨趋化因子对细胞分化的影响。 在高钙条件下，与低钙培养的细胞相比，在缺乏或存在CXCL10处理的情况下，NHKs表现出K10表达水平的增加，主要表现在K10( 图7，F和G)表明角质形成细胞在趋化因子的存在下保持了分化的能力。
图7 白癜风的炎症。
( A )的mRNA转录 白细胞介素1 β, 白细胞介素6 ，和 CXCL10型 应用qRT-PCR检测NHKs炎症基因( n =9）和VHKs( n =11）。 ( B )CXCL10和( C )酶联免疫吸附法测定非scratch和scratch NHKs中IL-1β的含量( n =3）和VHKs( n =3）在指定的时间点* P <0.05** P <0.01( D )的mRNA转录本 CXCR3型 应用qRT-PCR对NHKs进行评价( n =9）和VHKs( n =10）。 ( E )MTT法测定NHKs细胞活性( n =4）用增加浓度的CXCL10处理48小时。 结果表示为相对于生长在低钙环境中的未处理细胞的值的倍数变化，定义为1。 ( F )增加CXCL10浓度48小时后NHKs表面K10和总苞素的Western印迹和相应的密度分析。 显示了一个具有代表性的印迹。 ( G )K10和总苞素对NHKs的免疫荧光研究( n =3）用CXCL10治疗48小时。 细胞核用DAPI复染。 比例尺，50μm。
在非病变性白癜风表皮中可检测到分化标志物和炎症介质表达的变化 接下来，我们通过检查从白癜风患者非病变区收集的皮肤活组织检查整个表皮的结构排列，探讨体外观察到的角质形成细胞分化和组装缺陷是否明显。 组织学图像的定量分析显示，与对照皮肤相比，非病变白癜风皮肤中所有表皮层的厚度以及SC单独增加( 图8，A和B; * P <0.05和** P <0.01）。 白癜风患者和对照组的Ki67（图S5A）和应激衰老相关标记p16（图S5B）染色没有显著差异。 K10免疫组化分析显示，在对照组皮肤的所有基底上层均呈强阳性，但在大多数无病变的白癜风标本中，K10的信号向表皮层呈局灶性延迟( 图8C). 图像分析显示，与对照组相比，白癜风患者的信号分布显著减少( 图8C; ** P <0.01）。 同样，对照皮肤基底上表皮层的总苞素呈阳性，而在非病变的白癜风皮肤中，相应的信号显著降低，这是通过定量图像分析来评估的( 图8C; ** P <0.01）。 因此，早期和晚期分化标志物的弱表达表明，通过体外诱导角质形成细胞的分化过程检测到的变化反映了白癜风患者的皮肤特征。 作为与皮肤屏障形成相关的额外指标，我们检测了TGM1的表达，以确定其在形成构成皮肤屏障的角质化包膜中的关键作用。 图像分析显示，与对照皮肤相比，无病变白癜风皮肤最外层的TGM1免疫荧光强度明显降低，且不连续性更强( 图8C; ** P <0.01）。 免疫组化法检测炎性介质和趋化因子的表达，图像分析法检测阳性区域； IFN-γ呈零星低水平表达，各组间无显著差异( 图8D)而CXCL10免疫反应性在非病变性白癜风皮肤中显著增强，尽管标记程度在不同标本之间存在差异( 图8E; ** P <0.01）。 最后，评估分化和炎症标志物表达的改变是否伴有CD8的存在 + T淋巴细胞浸润，CD8免疫组化分析 + T细胞。 结果显示少数细胞分散在整个切片中，主要分布在血管周围区域（图S5C）。
图8 非病变性白癜风皮肤的体外特征。
( A )苏木精和伊红染色切片来自对照和非病变白癜风皮肤。 刻度条，50μm。 ( B )表皮厚度测量，SC，表皮加上对照和白癜风皮肤样本的SC。 值用平均值表示（对照皮肤 n =15，非病变性白癜风皮肤 n =28）。 ( C )对照组K10（左）和总苞素（中）阳性染色面积/总面积的免疫组化和图像分析测量( n =5）和白癜风皮肤( n =10）。 基底膜轮廓为黑色虚线。 用苏木精复染细胞核。 （C） 右图：TGM1表达的免疫荧光和图像分析测量（对照皮肤 n =5； 非病变性白癜风皮肤 n =11）。 用DAPI复染细胞核。 基底膜用白色虚线勾勒。 刻度条，50μm。 箭头指向被评估标记的低表达区域。 IFN-γ免疫组化及图像分析( D )和CXCL10( E )控制( n =5）和白癜风皮肤( n =9）。 刻度条，50μm。 框内区域表示选定框架的放大视图。
讨论 在这项研究中，我们的目的是评估白癜风患者色素皮肤的形态和功能特征，以及脂类成分。 此外，我们还研究了这些表皮特征与黑素细胞破坏的免疫反应激活之间的可能联系。 通过分析角质形成细胞培养和皮肤活检获得体外和体外证据，并通过评估角质形成细胞形态和表皮脂质成分获得体外证据。 在这里，我们在正常白癜风皮肤中发现了表皮缺陷和改变了皮肤屏障脂质成分。 非损伤性VHKs表现为形态增大，增殖率低，分化障碍明显，包括层积和屏障组装不良。 细胞大小的增大与角质形成细胞的分化有关( 50, 51). 然而，老化角质形成细胞的细胞大小也会增加( 52– 54). 另外，先前报道的数据显示，衰老的角质形成细胞的分化过程明显慢于非衰老的角质形成细胞( 52). 因此，我们观察到在非损伤性白癜风皮肤切片中，对衰老标志物p16呈阳性的角质形成细胞数量呈上升趋势，这与之前报道的类似样本中存在应激和衰老相关标记物的情况一致( 55).
在白癜风皮肤角质形成细胞培养中，已经描述了一个受损的衰老过程和试图控制它( 56). 尽管这项研究的重点是病变角质形成细胞的体外行为改变，但在首次培养传代时就已经很明显的p16表达水平在未感染的细胞中已经被报道，与它们的相关对应细胞相比。
因此，所显示的特征提示非病变角质形成细胞的衰老倾向性行为，如白癜风黑素细胞和成纤维细胞所报道的那样( 5, 55).
对分化调控解除的机制的研究表明，在非病变性白癜风黑素细胞和成纤维细胞中存在内在代谢缺陷( 6, 29). 我们发现VHK患者的基础ATP水平低于NHK患者。 据报道，由于抑制F1F0-ATP合酶（也称为线粒体复合物V）而导致细胞内ATP合成减少，导致角质形成细胞分化标记物的表达下调，从而在能量代谢和细胞行为（如分化）之间提供联系( 34). 线粒体转录因子TFAM在白癜风细胞中的平行表达减少表明线粒体相关能量受损。 TFAM对线粒体功能起着至关重要的调节作用，包括线粒体编码的呼吸链亚单位的表达，这些亚单位对能量的产生以及线粒体DNA的转录和复制至关重要( 30– 32). 在用线粒体解偶联剂DNP治疗后，kerct细胞系出现分化相关异常，进一步表明线粒体是损害角质形成细胞分化的功能和能量衰竭的根源。 在白癜风黑素细胞中，ATP的低生成伴随着控制糖酵解代谢的酶的同时上调( 29). 这种无氧糖酵解的诱导可能是线粒体ATP生成降低的一种代偿策略，但同时也会削弱分化能力，因为糖酵解代谢关键调节因子如6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的异常表达， 已经证明可以抑制角质形成细胞的分化( 57).
当角质形成细胞分化时，它们形成细胞-细胞接触并开始在表皮多层膜中聚集。 E-钙粘蛋白是分化后细胞适当分层的关键决定因素。 此外，E-cadherin是调节角质形成细胞和黑素细胞相互作用的主要粘附分子。 在正常色素沉着的皮肤黑素细胞中，E-钙粘蛋白表达和分布的缺陷已经被强调。 也有研究表明，这种粘附性受损会影响黑素细胞对氧化和机械应激的抵抗力，这表明临床前原发性皮肤缺损的存在有利于黑素细胞的脱落和丢失( 14). 我们的结果显示角质形成细胞在分化和分层过程中适当组织细胞接触的能力降低，从而证明在非病变黑素细胞中报告的E-钙粘蛋白表达受损扩展到整个表皮。 与NHKs相比，VHKs中E-cadherin的分布不均匀可能是由于ATP水平较低造成的，因为其耗尽会干扰E-cadherin的定位并使其降解( 58). 同样，异常的ATP浓度也可以作为VHKs诱导分化的肌动蛋白细胞骨架重组的基础，正如之前在Hailey-Hailey角质形成细胞中所报道的那样( 59). 因此，这些固有的代谢损伤使VHKs不能产生足够的能量来进行适当的分化和分层。
与角质形成细胞分化的变化平行，皮肤屏障的完整性也对脂质成分的正确平衡敏感。 在目前的研究中，我们注意到非病变性白癜风皮肤的表皮脂成分发生了改变，CER水平显著降低，FFA、CH和CHS水平升高。 这些脂类的合成、释放、定位和结合在形成完整且维护良好的SC和完全胜任的渗透屏障方面起着关键作用( 60). 总CER水平和亚类比率的改变与皮肤屏障损伤有关( 44)糖基化短链和LC-CERs促进角质形成细胞的分化( 61).
在白癜风患者中，CER的减少可以作为表皮层内增殖和分化平衡改变的一个指标。 在体外暴露于促分化刺激后，VHKs显示皮肤屏障脂质相关酶的表达受损，如 CERS3 和 ELOVL4型 这与体外和体外检测到的VLC和ULC-FAs相关的cer减少相一致。 在分化后VHKs和NHKs之间FAS表达没有差异，这一发现支持了这样一个假设：SC中FFA的增加源于CER合成途径的放松调控，而不是FFA的生物合成。 CH和CHS的增加与抑制表皮脱落和SC增厚有关( 62)这可以解释白癜风患者表皮增厚的原因。 这些结果也反映了白癜风角质细胞中存在着比对照组更高的内聚性，通过胶带剥离去除的蛋白质含量的降低进行了评估，这是一种可靠的方法来测量SC的凝聚力( 40, 41). 因此，白癜风患者与对照组之间的脂质含量和角质细胞粘附性的差异提示白癜风患者的皮肤屏障结构发生了改变。 我们观察到，与对照组相比，病变和非病变角质细胞的FFA含量表现出相似的差异。 据我们所知，在白癜风患者中，与调节脂质屏障合成的酶的表达谱相关的SC的综合脂质体分析以前还没有进行过。 角质形成细胞分化和角质化基因stratifin、角质结皮素、envoplakin、periplakin和转谷氨酰胺酶1在皮损和非皮损表皮中的表达减少，与丝状蛋白和总苞素的表达无变化有关( 11). 然而，与我们的研究不同的是，与正常对照皮肤没有相关性。 在我们的样本中观察到的皮损和非皮损之间的脂质成分没有差异，这与之前的数据一致，即白癜风累及部位的基底TEWL（经皮失水）与非皮损皮肤无显著差异( 12). 另一方面，与非损伤部位相比，损伤部位的屏障恢复明显延迟( 12). 根据这些数据，我们可以推测，当机械损伤作用于非损伤皮肤时，可能会导致内在改变的脂质屏障成分额外但短暂的恶化，从而触发针对黑素细胞的免疫反应。 一旦病变稳定下来，皮肤屏障可能会部分恢复。
表皮细胞分化和皮肤屏障成分的改变可以刺激角质形成细胞招募免疫细胞，并释放炎症介质，从而发挥免疫传感器的作用。 皮肤屏障损伤与免疫反应失调有关。 白癜风中的炎症信号预示着表皮树突状细胞和自然杀伤细胞（NK）的激活，这些细胞释放IFN-γ，刺激角质形成细胞产生趋化因子，进而获得并激活细胞毒性CD8 + T细胞。 炎症介质包括IFN-γ、肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-1细胞因子以及趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL16在病变和周围皮肤中的表达增加已被广泛报道( 48, 63– 65). 一些研究试图将其中一些信使定义为疾病活动性和严重程度的可能可靠的生物标志物，无论是在血清水平还是在组织水平( 21, 64, 65). 特别是，吸出水泡液中检测到的CXCL10水平已被报道在活动性白癜风中显著高于稳定的疾病。 反过来，稳定的皮损表现出比非皮损更高的趋化因子水平( 64). 然而，究竟是什么导致皮肤中炎症细胞的募集和维持还没有完全明确。 阐明这些机制可能为抑制或阻止临床表现的出现和蔓延提供可行的靶点。 最近，一项从皮损和非皮损处获得的抽吸性水疱的单细胞RNA测序研究发现了以前在皮损区域没有报道过的细胞间信号，研究人员在白癜风表皮内产生了一个全面的细胞间通讯相互作用组。 此外，这些作者证明非病变皮肤处于持续的亚临床炎症状态( 24). 在本研究中，我们没有检测到白癜风和对照皮肤样品表皮IFN-γ表达的差异。 因此，在白癜风中，适当的表皮组织和屏障组成的缺陷可能会触发刺激局部促炎信号的产生( 66)首先是先天性免疫反应，然后是适应性免疫反应，导致黑素细胞丢失。 因此，我们发现VHKs比NHKs更能自发分泌IL-1β，尤其是CXCL10。 在一个模拟机械应力的模型中，VHKs的体外擦伤Koebnerization模型、IL-1β和CXCL10的产生进一步上调。 缺陷角质形成细胞分化和屏障成分的改变可能代表了Koebner现象的启动决定因素，Koebner现象被定义为皮肤病患者创伤后未受累皮肤区域新病变的发生( 45, 46). 这一假设得到了在非病变白癜风皮肤样本中检测到的CXCL10阳性的进一步支持，与先前的研究一致( 23). 因此，角质形成细胞分化的缺陷和异常的脂质屏障成分可能是观察到的持续性炎症的功能基础和Koebner现象的原因。 确定病变区和非病变区脂质成分的类似改变，以及CER、FFA、CH之间缺乏相关性， 或者CHS水平和疾病程度或持续时间支持这样一种观点：皮肤屏障的不平衡结构不是炎症过程的结果，而是色素沉着白癜风皮肤的组成特征。 与这一假设相一致，我们的研究结果表明重组CXCL10的治疗不会损害角质形成细胞的分化能力，这进一步表明角质形成细胞行为改变的原因是内在缺陷，而不是先前存在的炎症环境。 在机械性或应激性损伤后，角质形成细胞的活化可能加剧，从而导致CD8的逐渐增加 + T细胞浸润。 因此，在非病变皮肤中检测到的表皮改变伴随着少量CD8的存在 + T细胞。 一旦受到刺激，角质形成细胞可能会释放更多的促炎介质，以及其他因子，如基质金属蛋白酶（MMP）–9( 67)从而导致黑素细胞微环境失衡，促进黑素细胞出血和经皮黑素细胞丢失。 单卵双胞胎白癜风症状的有限一致性进一步强调了环境因素在该病中的关键作用( 68).
我们研究的一个局限性是主要根据临床症状和医生的主观评估来定义疾病活动。 此外，我们没有使用客观的测量来评估皮肤屏障的功能，也没有评估治疗后的成分和功能，如光疗。 对从对治疗有反应的患者中收集的样本进行的调查将有助于验证我们的发现，并可能提供一个良好的临床翻译。 总的来说，我们的数据确定了非病变角质形成细胞的结构和功能特性的改变，表明表皮是白癜风多方面发病机制中一个未知的关键因素。 因此，有针对性的治疗方法，旨在改善固有的表皮缺损，可以提供有效的保护，防止白癜风色素脱失的发生和发展，即使是在皮损尚未发展的皮肤区域。
材料和方法 研究设计 本研究的目的是：（1）探讨白癜风患者角质形成细胞的分化过程及皮肤屏障的脂质组成； 二确定可能存在的规章制度失调的根本机制； 以及（iii）研究角质形成细胞相关的改变是否构成促进局部炎症发展的因素，该炎症负责激活免疫浸润。 这项研究的对象是圣加利卡诺皮肤病研究所白癜风科IFO-IRCCS。 IFO机构研究伦理委员会（Instituti Regina Elena e San Gallicano）Fondazione Bietti批准了这项研究，并在患者和健康志愿者的登记过程中获得了知情的书面同意。 这项研究是根据赫尔辛基宣言原则准则进行的。 我们建立了非病变性白癜风角质形成细胞和对照角质形成细胞的原代培养，我们收集了SC样本并检查了石蜡包埋的皮肤活检。 采用实时定量RT-PCR技术对样品进行基因表达分析； （ii）使用Western blot、ELISA、免疫荧光和免疫组化分析进行蛋白质表达； 以及（iii）采用GC-MS和HPLC-MS的脂质组分方法。 对于每个实验，至少使用三个生物复制品，并且数据分析不是盲目的。 样本量和 P 在每个地物图例中报告值。
研究参与者和批准 这项研究是在圣加利卡诺皮肤病研究所（San Gallicano Deatological Institute）的白癜风科（IFO-IRCC）的患者身上进行的。 没有特定疾病的资格标准，任何愿意遵守研究程序的白癜风患者都被纳入研究。 本研究共招募86名白癜风患者和49名健康志愿者。 IFO机构研究伦理委员会（Instituti Regina Elena e San Gallicano）Fondazione Bietti批准了这项研究，并在患者和健康志愿者的登记过程中获得了知情的书面同意。 这项研究是根据赫尔辛基宣言原则准则进行的。 排除标准包括任何可能改变临床评估的皮肤病、先前治疗的使用，如局部治疗（皮质类固醇、局部钙调神经磷酸酶抑制剂、化妆品和伪装物）、12周内的先前光疗和检查后8周内的任何全身免疫调节。 在研究访问期间，获得了每个患者的详细医疗背景，包括白癜风病史。 VES测量由一位在白癜风诊断和治疗方面经验丰富的皮肤科医生进行。 此外，收集所有参与研究的患者的SC样本。
患者特征 主要的人口统计学和疾病特征如表S3和S4所示。在86名患者中，47名为女性，39名为男性，平均年龄为43.6岁（范围为22至71岁）。 白癜风病程2～48年，平均15.1年。 总的来说，所有患者都受到白癜风全球问题共识会议（VGICC）定义的非节段性白癜风的影响，并被纳入评估。 表S4显示了患者组内不同的白癜风亚型。面部白癜风是最常见的亚型，其次是弥漫性白癜风。 总的来说，VES评分的平均值为2.65（范围为0.135至15.3875）。 没有患者表现出临床活动标记，如五彩纸屑样脱色、Koebner现象和三色病变，而患者报告的活动被认为是不可靠的，因此排除在任何评估之外。 每一个登记的病人在我们的研究所进行了随访，强调最近没有白癜风的出现，至少疾病持续时间为2年。
细胞培养和处理 如前所述，从对照皮肤和非皮损性白癜风皮肤中分离出人角质形成细胞（NHK和VHK）的原代培养物，并将其培养在154培养基中（意大利蒙扎Life Technologies Italia），并辅以人角质形成细胞生长补充剂（HKGS）（Life Technologies Italy），以及抗生素和Ca 二+ （0.07毫米）。 细胞每周传代一次，在第2代和第4代之间进行实验。通过改变培养基中钙浓度由低（0.07mm）到高（1.8mm），诱导角质形成细胞分化。 或者，让角质形成细胞达到密度介导的分化，在低钙和HKGS补充的培养基中维持细胞7、10和14天。 永生化的人角质形成细胞系Ker-CT（美国型培养标本集CRL-4048）保存在含有HKGS（意大利生命技术公司）、抗生素和0.1 mM Ca的规定培养基154中 二+ 在DNP（Sigma-Aldrich）实验中，将kerct细胞培养在154培养基中，外加抗生素和Ca 二+ 在有或无DNP（0.05至0.1mm）的情况下，在低浓度或高浓度下持续48小时。 对于CXCL10（Peprotech，伦敦，英国）的实验，NHK保存在高Ca的培养基中 二+ 用趋化因子浓度增加处理48小时。
免疫荧光分析 用4%多聚甲醛和0.1%Triton X-100固定角质形成细胞，使其渗透，或在低温甲醇中固定 ? 20摄氏度。 然后用以下主要抗体培养细胞：抗Ki67兔多克隆抗体（1:500；Abcam，剑桥科技园，英国剑桥），抗细胞角蛋白10（K10）兔多克隆抗体（1:500；Abcam），抗包皮素兔多克隆抗体（1:100；Abcam）， 抗E-钙粘蛋白单克隆抗体（1:200；Dako Corp.，Carpentia，CA，USA）、抗ELOVL4兔多克隆抗体（1:100；Abcam）、抗LASS3/CERS3兔多克隆抗体（1:100；Abcam）、抗TGM1（1:200）兔多克隆抗体（Abcam）和抗TFAM兔单克隆抗体（1:100；Cell Signaling Technology，MA，USA）。 使用山羊抗兔Alexa-fluor546结合物和山羊抗小鼠Alexa-fluo488结合抗体（1:800；Thermo-Fisher-Scientific，意大利）观察主要抗体。 使用含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogen）的长效金防褪色试剂安装盖玻片。 荧光信号是通过使用电荷耦合设备相机（蔡司，奥伯科钦，德国）记录染色图像来分析的。 通过计算NHKs=5和VHKs=5的至少1800个细胞来评估Ki67阳性细胞的百分比，结果代表每个样本中阳性细胞/总细胞的百分比。 为了测量细胞面积，至少测量了1000个细胞（NHKs=6和VHKs=6），结果用平均面积/细胞（μm）表示 2 )对于每个样品。 使用Zen 2.6（blue edition）软件（蔡司）对NHKs=4和VHKs=4的至少700个细胞进行TFAM荧光强度的定量分析。结果用每个样本的强度平均值/细胞表示。 用抗角质结蛋白多克隆抗体（1:100；Abcam）对剥离的角质细胞进行免疫标记，然后用山羊抗兔Alexa Fluor546结合物（1:800；Thermo Fisher Scientific，意大利）进行免疫标记。
夹心ELISA法测定蛋白质 对照组和白癜风角质形成细胞的上清液中的CXCL10和IL-1β按照制造商的协议，使用市售的ELISA试剂盒（Biotech Co.Ltd.）进行分析。 从原代细胞获得的结果被标准化，以每1×10的皮克图表示 6 细胞。
RNA提取与实时定量PCR 使用Aurum总RNA微型试剂盒（意大利米兰Bio-Rad Laboratories Srl）分离总RNA。 通过OD260/280吸光度测量，确定了RNA的产量、纯度和质量。 根据制造商的说明，使用回复性第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Monza，Italy）从1μg总RNA中合成cDNA。 在含有2X ChamQ通用SYBR-qPCR母料（Vazyme-Biotech）和25pmol正反向引物的反应混合物中进行定量实时RT-PCR。 所有引物的序列如表S5所示。使用CFX96实时系统（Bio-Rad Laboratories Srl）进行三次反应。 对每个基因进行熔融曲线分析，以确保扩增产物的特异性。 基因表达水平用2 ? ΔΔCT 方法：以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内源性对照，与未经处理的对照细胞相对表达。
免疫印迹分析 用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀试验缓冲液制备角质形成细胞提取物，用Bradford蛋白分析试剂（Bio-Rad）测定细胞裂解液浓度。 等量的蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，转移到硝酸纤维素膜上（意大利米兰，Amersham Biosciences），然后用以下主要抗体处理：抗细胞角蛋白10兔多克隆抗体（1:1000；Abcam）、抗包皮素兔多克隆抗体（1:500；Abcam）， 抗ELOVL4兔多克隆抗体（1:500；Abcam）、抗LASS3/CERS3兔多克隆抗体（1:500；Abcam）、抗TGM1兔多克隆抗体（1:500；Abcam）和抗TFAM兔单克隆抗体（1:1000；细胞信号技术）。 以抗Gapdh兔多克隆抗体（美国加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）作为负载对照。 采用二级抗兔免疫球蛋白G（IgG）辣根过氧化物酶（HRP）结合抗体和抗小鼠IgG-HRP结合抗体。 化学发光法检测抗体复合物。 通过使用GS-800校准图像密度计（Bio-Rad Laboratories Srl，Milan，Italy）或UVITEC Mini HD9采集系统（Alliance UVITEC Ltd.，Cambridge）测量特定波段的光密度来进行成像和密度分析。
免疫组织化学 从福尔马林固定和石蜡包埋的连续切片（3μm）中脱蜡并通过分级乙醇到磷酸盐缓冲盐水进行再水化。 抗原回收后，组织切片用以下主要抗体培养：抗Ki67单克隆抗体（MIB-1，Dako，Agilent，Santa Clara，CA，USA），抗p16小鼠单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，意大利），抗细胞角蛋白10兔多克隆抗体（1:500；Abcam）， 抗包皮素兔多克隆抗体（1:300；Abcam）、抗IP-10多克隆抗体（1:200）、抗IFN-γ多克隆抗体（1:400）、抗CD8单克隆抗体（克隆C8/144B，Dako）。 以3-氨基-9-乙基咔唑或3,3′-二氨基联苯胺为底物，用热超声量子检测系统HRP观察染色。 所有切片均用苏木精复染。 抗原回收是通过加热部分在pH9和pH6的抗IP10抗体实现的。 阴性对照通过省略主要抗体获得。 TGM1免疫荧光染色时，将组织切片脱蜡处理以提取抗原，然后与抗TGM1多克隆抗体（1:200）（Abcam）孵育。 然后使用山羊抗兔Alexa-fluor546结合物（1:800；Thermo-Fisher Scientific）观察主要抗体。 载玻片采用含DAPI（Invitrogen）的长效金防褪色试剂。 使用Zen2.6（blue edition）软件（Zeiss）对阳性面积/总面积进行测量，结果用每个样本的平均值表示。 用zen2.6（blueedition）软件测量表皮厚度，结果用平均厚度值±SD表示。
人体SC采样 如前所述，用D-鳞片连续剥离患者前臂掌侧表面的SC（美国德克萨斯州达拉斯市CuDerm公司）( 69). 简单地说，用一个D-方形贴片剥离三倍于确定的取样面积来去除非常浅的悬浮微粒，并将其视为清洁盘。 在用细尖笔标记胶带的初始位置后，为取样准备了四个贴片，并在每个没有表面SC的区域进行了三次剥离。对于白癜风受试者，SC是从明显未受影响的区域收集的。 收集的补丁存储在 ? 80°C直至加工。 同样的评估也在一个由医院人员组成的对照组中进行，这个对照组的性别和年龄与白癜风组相匹配。
ATP测定 根据制造商的说明，使用商用ATP比色/荧光测定试剂盒（BioVision）测量细胞内ATP水平。 结果报告为ATP含量/1×10 6 细胞。
MTT法 然后在37℃下用CXCL10处理的NHK与3-（4,5-二甲基-2-噻唑烷基）-2,5-二苯基-2H-四唑溴化铵（MTT）（1 mg/ml）孵育2小时，并在二甲基亚砜中裂解。 用分光光度计DTX880多模检测器（Beckman Coulter Srl，米兰，意大利）测量570 nm处的吸光度。 结果表现为相对于在低钙环境中生长的未处理细胞的值的倍数变化 二+ ，定义为1。
SC蛋白的提取与测定 SC蛋白含量用于定量胶带剥离去除的SC。 蛋白质提取如Raj之前所述 等等。 ( 70)稍作修改。 简单地说，将两片D-鳞片在1.5 ml Eppendorf管中与750μl 1 M氢氧化钠溶液一起培养，并使用热混合器（德国汉堡，Eppendorf）以1400 rpm在37℃下摇动1小时。 然后添加1 M盐酸中和SC蛋白质溶液。 根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，MO，Italy）使用皮尔斯BCA蛋白质分析试剂盒测定蛋白质含量。 在测量562nm处的吸光度之前，将微板在37℃下培养2小时。 将每个样品的蛋白质含量分析为两份，将平均值视为正确值。 对于所分析的每个微板，新制备校准曲线，并对两个空白D-鳞片进行上述相同的提取程序，用于最小化背景信号。
D-鳞片脂质提取 用含有0.025%丁基羟基甲苯（BHT；Sigma-Aldrich，意大利米兰）的2mL乙醇（德国达姆施塔特默克公司）从两个D-Squame中提取SC脂质，以防止氧化。 在加入200μl氘化内标物后提取样品，所述氘化内标物含有100μM d6胆固醇（d6CH）、25μM d7胆固醇硫酸盐（d7CHS）、50μM d17棕榈酸（d17PA）、10μM N -棕榈酰-d31- d -红鞘氨醇（d31CER16:0）和0.01%BHT，丙酮/甲醇/异丙醇（40/40/20）。 将用于提取的乙醇转移到2-ml Eppendorf管中，在4°C下以18000 rpm离心10分钟，然后通过带有0.2-μm PTFE膜的滤板过滤（Captiva，过滤板，安捷伦技术公司，加利福尼亚州，美国）。 在氮气下蒸发至干燥后，样品提取物储存在 ? 在分析之前，将其溶解在250μl丙酮/甲醇/异丙醇（40/40/20）中。
GC-MS脂质分析 以含1%三甲基氯硅烷的N，O-双-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺为催化剂（Sigma-Aldrich，米兰，意大利）直接硅烷化后的ffa和胆固醇（CH）进行分析。 在60°C下30分钟后，使用GC 7890A与MS 5975 VL分析仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉市，美国）对样品进行分析。 以氦气为载气，在HP-5MS（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉市）毛细管柱（30 m×250μm×0.25μm）上进行色谱分离。 使用的烘箱温度梯度为80°C至200°C（8°C/min）和250°C（10°C/min）。 注射器和气相色谱（GC）-MS转移线分别保持在260°C和280°C。 样品采用电子冲击质谱（electronic impact MS）进行扫描分析，通过与真实标准品的比较以及与图书馆光谱数据的匹配，验证了检测到的ffa的一致性。 用不同ffa的校准曲线进行定量分析，结果以微克每毫克SC蛋白质的形式报告。
超高效液相色谱/电喷雾电离-MS/MS脂质分析 CER和CHS分析采用超高效液相色谱法（1200 HPLC液相色谱系统；安捷伦技术公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托市，美国）与带电喷雾电离的三重四极质谱仪（6400三重四极LC/MS，安捷伦技术公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）进行CER和CHS分析。 使用C8柱（Zorbax SB-C8快速分辨率HT，1.8μm，2.1×100 mm；安捷伦技术公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）和溶剂a（含0.1%甲酸的水）和溶剂B（甲醇和0.1%甲酸）的梯度分离，如下所示：0.2 ml/min 30%B（0-1 min），0.2 ml/min 30-70%B（1-2.5 min）， 0.2毫升/分钟70至80%乙（2.5至4分钟）、0.3毫升/分钟80至90%乙（4至8分钟）、0.3毫升/分钟90%乙（8至50分钟）、0.2毫升/分钟90%乙（50至52分钟）及0.2毫升/分钟90至30%乙（52至60分钟）。 柱温保持在40°C。 使用氦作为碰撞气体对CER进行破碎，并在正离子模式下通过MRM进行监测（参数见表S1）。 使用类别特异性内标d31CER16:0对分析物进行相对定量，结果以微克每毫克SC蛋白质的形式报告。
使用C18柱（对称，3.5μm，2.1×100 mm 1，Waters，Wilmslow，UK）和溶剂a（乙腈-水-甲酸20:80:0.1，v/v/v）和溶剂B（乙腈和0.1%甲酸）的梯度进行CHS分离。 流动相B在6分钟内以线性梯度从0增加到100%，并保持在100%直到10分钟。然后流动相B从10到11分钟降低到0%，并保持在0%直到22分钟。总运行时间为25分钟。柱温保持在40°C。 用磁共振波谱仪（MRM）在负离子模式下裂解CHS，并监测以下跃迁：chs465 → 97和d7 CHS（用于CHS）472 → 对于CHS定量，生成一条线性曲线，其中分析物标准峰面积与内标物峰面积之比与分析物标准物量之比。 结果以微克每毫克SC蛋白质的形式报告。
统计分析 使用统计和数据分析Python库Scipy和Statsmodels以及MatLab（9.4.0版本R2018a；Mathworks，Natick，MA）对数据进行分析。
学生的 t 检验和方差分析与Tukey的事后检验分别用于评估两组或更多组之间连续变量的差异。 皮尔逊系数( R )用于测量两个定量变量之间的相关性。 差异和相关性被认为具有统计学意义 P <0.05。对于脂质组学分析，FFA、CH、CHS和CER的绝对值（以每毫克SC蛋白微克或纳克计）进行对数转换和标准化； 此外，考虑到实验的多变量性质，使用ASCA评估了控制因素对色谱图的显著影响( 71).
