编辑推荐：
多重耐药超级细菌引起的医院感染在上升。加州大学研究人员开发了一种纳米类毒素疫苗能产生快速持久免疫，即使严重免疫缺陷也能防止致命感染。免疫低下者术前接种该疫苗有望预防医院感染，减轻抗药性超级细菌威胁。
由多重耐药病原体引起的医院感染上升是一个主要的公共卫生问题。服用免疫抑制剂或化疗药物的病人自然更容易感染。因此，保护免疫缺陷者免受感染的策略非常重要。美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员开发了一种纳米类毒素疫苗，在动物模型中保护免疫缺陷动物有效对抗耐药超级细菌绿脓假单胞菌。 疫苗使用巨噬细胞膜包被隔离细菌毒性因子。接种纳米制剂可产生快速和持久的免疫，即使严重免疫缺陷也能防止致命感染。这种纳米疫苗可以通过多种途径接种，对肺炎和败血症感染模型都有效。保护是由中性粒细胞和病原体特异性抗体介导的。总的来说，这一种有吸引力的策略，可以保护易受感染的患者，并有助于减轻抗药性超级细菌带来的威胁。
背景
应对抗生素耐药性病原体的一个新策略是使用纳米类毒素进行疫苗接种。在感染过程中，细菌分泌大量的毒力因子来协助定植。这些有毒分泌物是疫苗开发的有吸引力的目标，但需要采取有效的战略，在不损害免疫原性和抗原性的情况下提高其安全性。由于细菌毒素必须与靶细胞的质膜结合才能发挥其活性，因此天然形式的细菌毒素可以用天然来源的宿主细胞膜来包被成为纳米粒子以隔离其毒性，用作安全激发抗菌免疫的疫苗。
该策略已成功应用于抗甲氧西林金黄色葡萄球菌和P.铜绿假单胞菌，这两种兼具高毒性和耐药性的细菌都属于ESKAPE病原体的名单，是世界卫生组织指明最迫切需要新型抗生素的三种多药耐药病原菌之一。许多实验性疫苗已显示出潜力，但尚没有一种得到临床许可。
研究摘要
本文作者评估了一种巨噬细胞膜包被的纳米类毒素（MΦ-NT）疫苗，在由DNA烷基化剂环磷酰胺（CP）诱导的临床相关免疫缺陷小鼠模型中能产生针对铜绿假单胞菌的长达4个月的免疫力。环磷酰胺是一种常用的化疗和免疫抑制剂，具有去白细胞作用。如果不接种疫苗，免疫系统受损的小鼠对铜绿假单胞菌入侵高度敏感。在诱导免疫缺陷之前接受MΦ-NT疫苗的小鼠，与同时接种纳米类毒素疫苗的完全免疫正常小鼠受到的保护程度相同。在细菌感染的肺炎和败血症模型中评估了有效性，皮下和鼻内免疫途径均取得了显著的保护作用。在机制上，中性粒细胞和铜绿假单胞菌特异性抗体被确定为细菌负荷降低的主要贡献者。用适量MΦ-NT接种疫苗后，小鼠迅速产生了持续至少4个月的免疫力。此外，在与年龄相关的免疫缺陷模型中，接受MΦ-NT的72周龄老年小鼠和接种疫苗的年轻小鼠均能够抵抗感染。研究还证明了MΦ-NT可以用来自人类细胞系的质膜来制备，突显了这种疫苗接种策略的临床潜力。
研究亮点
MΦ-NT可引起快速、持久的免疫：利用巨噬细胞膜包裹纳米粒（MΦ-NPs）、从临床分离的铜绿假单胞菌培养液中分离的蛋白质组分（经蛋白质组学分析），制备MΦ-NT。实验证实，在配制成MΦ-NT后，分离的铜绿假单胞菌分泌物（PaS）毒性完全减弱。实验小鼠皮下注射MΦ-NT对体重无显著影响，对循环血细胞数和血清生物标志物水平的影响可忽略不计，血清中循环免疫球蛋白G（IgG）抗体分析表明抗体水平在注射3天后开始升高，大约5天后达到峰值，10μg剂量的 MΦ-NT可令抗体滴度达到饱和。剂量的进一步增加不会显著改变免疫反应。在最初的疫苗接种后1周和2周注射的增强剂并没有进一步提高抗体滴度水平。MΦ-NT诱导的抗体反应在一个月后趋于稳定，并在至少4个月内保持升高。所有后续研究均使用单次100μg MΦ-NT剂量，以确保抗体滴度饱和。
单剂量免疫后分析在肺炎小鼠模型中快速产生的抗体具有保护作用：在小鼠模型接种疫苗后的不同时间，在气管内给与铜绿假单胞菌诱导肺炎，并在1天后量化肺部的细菌负荷。结果表明抗体效价与细菌负荷呈极显著的负相关。随着疫苗接种和细菌感染之间的时间延长，肺部的细菌数量逐渐减少，直到接种后5天达到最小值。只要一剂MΦ-NT，抗铜绿假单胞菌抗体两周后滴度稳定，至少4个月保持不变。持续的血清抗体表明免疫持久，因为在接种疫苗4个月后在给予铜绿假单胞菌刺激依然能激发强烈的抵抗铜绿假单胞菌肺部感染。
CP诱导白细胞减少的免疫缺陷小鼠模型，增加细菌感染的易感性
为了评估MΦ-NT在高危人群中的临床相关性，用化疗诱导的免疫缺陷动物模型。CP在临床上被用于治疗癌症、自身免疫性疾病和移植排斥反应，并且该药物已被广泛用于研究免疫功能低下个体的各种医疗干预的潜在有效性。小鼠腹腔注射150 mg/kg剂量的CP，一天后循环中的T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、炎性单核细胞和中性粒细胞下降。最显著的是，B细胞的数量减少了20倍以上，而巨噬细胞和炎性单核细胞减少了大约10倍。抗疾病免疫细胞亚群的大量减少会导致免疫系统受损，增加细菌感染的风险。与健康小鼠相比，CP诱导的免疫缺陷小鼠更容易被铜绿假单胞菌感染，死亡率更高。在相同的细菌剂量下，CP处理的小鼠肺部的细菌负荷显著高于健康小鼠。
皮下接种和鼻内接种MΦ-NT对免疫缺陷小鼠的免疫保护作用
在证实CP治疗可增加细菌感染的易感性后，接下来在免疫缺陷小鼠中研究MΦ-NT疫苗的益处。动物于第0天在颈部皮下注射MΦ-NT，第5天腹腔注射CP，第7天用铜绿假单胞菌进行气管感染。收集血清样本以评估抗体滴度。接种MΦ-NT疫苗可诱导产生比未接种对照小鼠高4个数量级的强抗体。所有接种疫苗的健康对照组均存活，接种疫苗的免疫缺陷小鼠6只有5只存活，未接种疫苗小鼠绝大多数3天内死亡。 所有接种疫苗的小鼠肺部的细菌负荷都显著低于未接种疫苗的小鼠。
此外，还采用败血症模型检查了疫苗对感染的防护。所有免疫MΦ-NT的小鼠都能在致命剂量的铜绿假单胞菌静脉注射中存活，所有未接种疫苗的小鼠都很快死于感染。这些结果提供了令人鼓舞的证据，证明MΦ-NT疫苗可以作为预防与获得性免疫缺陷相关的感染风险增加的保障，提供了类似于完全免疫能力强的个人所能获得的保护。
经鼻途径接种MΦ-NT能有效地诱导高IgG抗体滴度，尽管与皮下接种相比要低一些。免疫功能低下的小鼠模型经鼻接种MΦ-NT后，完全免于致命的肺部感染。在败血症模型中同样观察到了很强的疗效。
被动转移免疫血清可减少细菌负荷
在肺炎和败血症模型中，MΦ-NT能有效地对抗感染的保护机制可能是由于高抗体滴度，表明体液免疫可能起主要作用。为了证实这一假设，将接种了MΦ-NT的小鼠的血清静脉注射到幼年小鼠体内，然后气管给与铜绿假单胞菌。这种使用免疫血清的被动接种为受体小鼠提供了显著的保护，使其免受细菌感染。这种保护作用可与主动接种MΦ-NT的小鼠相媲美。在败血症模型中也观察到类似的结果。
中性粒细胞介导了免疫机能低下小鼠体内对细菌的清除
虽然抗体可以识别和调理病原体，但这些蛋白质本身并不能根除细菌。为了确定参与免疫清除的特定细胞类型，收集气管内感染小鼠的肺部进行免疫表型分型。与未感染的小鼠相比，感染导致肺部的树突状细胞和中性粒细胞显著增加。接种MΦ-NT并没有改变免疫细胞的增加幅度。经CP预处理的动物在先天性免疫细胞募集方面几乎完全消失，而在先前接种MΦ-NT疫苗的免疫缺陷小鼠中，树突状细胞和中性粒细胞的反应恢复。当分析败血症模型的外周血时，发现接种MΦ-NT疫苗的免疫缺陷小鼠的循环树突状细胞和中性粒细胞也有类似的增加趋势。一个有趣的观察结果是，与未感染的健康小鼠相比，感染健康小鼠的循环T细胞、B细胞、巨噬细胞和炎性单核细胞数量减少，这可能是由于已知铜绿假单胞菌感染可诱导淋巴细胞凋亡和损害先天免疫细胞。然而，接种MΦ-NT的小鼠白细胞计数没有下降。败血症模型感染后脾脏的分析也显示中性粒细胞计数增加。总的来说，这些数据的趋势显示了中性粒细胞募集在对抗铜绿假单胞菌感染。
除了住院病人外，另一个感染严重风险高的人群是老年人，因为免疫功能会随着年龄的增长而急剧下降。因此，作者研究了MΦ-NT对的72周龄小鼠保护能力。老年小鼠的循环T细胞和B细胞明显减少，而树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的数量增加。接种MΦ-NT后，幼年和老年动物的抗体滴度都提高到了相似的水平。气管给与铜绿假单胞菌，所有接种疫苗的小鼠肺部的细菌负荷和抗体水平相似，未接种MΦ-NT疫苗的老年小鼠更易感染，并在实验终点前死亡。
用人细胞膜制备的MΦ-NT具有良好的抗铜绿假单胞菌作用
在临床应用中，MΦ-NT的制造应使用人类细胞来源的质膜，以尽量减少不良的跨物种免疫反应。由于免疫系统不断暴露于自身抗原，物种匹配的细胞膜包被诱导自身免疫的几率很低。用THP-1细胞的膜代替原鼠的质膜进行纳米颗粒包被制备人MΦ-NT（hMΦ-NT）。这种质膜包被的纳米颗粒尺寸更大，增加到约125nm。hMΦ-NT在4°C溶液中稳定至少4周，细胞膜包裹的纳米制剂可以冻干长期储存。在确认安全性后，通过向小鼠皮下注射该制剂来评估hMΦ-NT作为疫苗的有效性。与使用小鼠MΦ-NT疫苗相似，hMΦ-NT疫苗可产生强的抗体滴度，降低了免疫缺陷小鼠肺部的细菌负荷，表明该制剂的免疫原性主要由PaS含量决定，而不是由细胞膜的任何物种特异性特征决定。综合而言，MΦ-NT是一个有效的疫苗平台，可以通过促进特异性和快速的免疫来保护高度敏感的免疫受损人群免受机会性感染。
讨论
这种纳米疫苗迅速引发了持续至少4个月的强大抗菌免疫。在肺炎和败血症感染模型中，接种疫苗的动物无论其免疫状态如何，都能得到强有力的保护。免疫主要通过高特异性抗体的存在以及中性粒细胞的募集来介导。由于所产生的抗体在很大程度上不受随后获得性免疫缺陷的影响，数据表明，即使是在接种疫苗后出现严重白细胞减少症的高度脆弱患者，在接受补充中性粒细胞输注治疗时，也可以从其他致命感染中获益。虽然研究主要是使用小鼠细胞膜制造的纳米颗粒来进行的，但当使用人的膜源时，也观察到了类似的抗感染保护作用。由于其易于合成，优良的安全性和良好的储存条件，纳米类毒素疫苗具有巨大的临床转化潜力，可大大有助于医院感染的临床管理。
