简介
哺乳动物的进化史是一个突出的例子，说明寿命可以改变100倍以上。跨物种分析表明，物种的最大寿命与成熟时间呈显著正相关，与体重呈正相关(1,2).与此相反，物种中较小的动物往往寿命更长，或者可以免受与年龄相关的疾病的影响，这一点在狗和人类的研究中得到了证明(三–6).这些联系可以用增长率对长寿的重要性来解释(1,2).胰岛素/胰岛素样生长因子1（IGF-1）信号转导相关的生长激素途径或基因的敲除导致生物体从蠕虫到小鼠的寿命延长(7–13)，这还与体型减小有关。此外，预先选择生长较慢的野生型老鼠比其快速成长的兄弟姐妹寿命更长(14).同样，与寿命较短的哺乳动物相比，寿命较长的哺乳动物的生长速度较低(15).这些发现表明，生物体的生长速度、体型和寿命之间存在因果关系。
一些间接证据支持生长信号抑制与寿命之间的因果关系，如果目标是在发育过程中。例如，生长激素基因敲除小鼠和缺乏生长激素分泌的小鼠比野生型同胞寿命高出50%(10,12).然而，如果在出生后早期接受生长激素治疗，它们的寿命就会缩短(16,17).同时，在成年期诱导的生长激素敲除对寿命没有影响(18).然而，目前还没有任何实验表明生长途径只在发育过程中被直接抑制，而且寿命结果也得到了测量。
雷帕霉素是雷帕霉素（mTOR）抑制剂的一个很好的机制性靶点，是目前最有效和最有效的延长小鼠寿命的药物干预措施之一。雷帕霉素可以延长寿命，如果在成人期(19,20)或者以后的生活(21,22)在各种小鼠品系中，包括遗传多样性的UMHET3小鼠（四个近交系的杂交）。雷帕霉素不能延长生长激素受体敲除小鼠的寿命(20).此外，早期生命（EL）雷帕霉素治疗曾被证明能抑制小鼠的生长(23).因此，雷帕霉素是一个很好的候选品来测试只有在生命早期才有针对性的生长是如何影响寿命的，我们在我们的研究中使用了它，考察了它对寿命、健康寿命、生物年龄和基因表达的影响。
结果
雷帕霉素在小鼠发育过程中的治疗会减弱小鼠的生长和繁殖开始
为了评估雷帕霉素对寿命的影响，我们建立了一个130只新生的UMHET3小鼠队列作为寿命实验，另一个由40只小鼠组成的独立队列进行健康寿命分析(图1A).以含有42%（百万分之42）的尤德拉吉特胶囊雷帕霉素或相应数量的包封材料作为对照，喂养有新生儿的母鼠。幼崽在20-22日龄时与母鼠分离，并继续以相同的雷帕霉素饲料喂养至45日龄(图1A).然后，这些动物被转移到一个正常的饮食和跟踪他们的余生。
图1雷帕霉素抑制基因异质小鼠的生长和繁殖。
(A)雷帕霉素治疗对小鼠寿命和健康影响的实验设计。RNA序列，RNA测序。糖耐量试验；胰岛素耐受试验。(B)2个月大的UMHET3小鼠在其生命的前45天内接受eudragit胶囊雷帕霉素或对照（含eudragit）饮食的代表性图像。(C和D)雷帕霉素对雄性（C）和雌性（D）小鼠体重的影响(n=30/性别）或对照组(n=每性别34至39）0至45天的饮食。阴影区显示雷帕霉素治疗的时间。数据为平均值±SE。(E)雷帕霉素对幼犬营养影响的实验设计。(F)7日龄幼崽体重增加的百分比，计算方法为：食用牛奶后的幼崽体重除以6小时饥饿期后和幼崽返回母鼠之前的群体平均体重，再乘以100。由于雷帕霉素和对照幼犬之间的基线体重差异，所以将平均体重用于各组内的标准化。(G)从分娩之日起，接受雷帕霉素或对照饮食的母鼠的乳蛋白浓度。(H)繁育者在发育期间接受雷帕霉素或对照饲料所生的幼崽数量。(我)雷帕霉素治疗组和对照组育种者怀孕间隔时间*P<0.05****P<0.0001；ns，不重要。
扩展以获取更多在查看器中打开雷帕霉素治疗EL导致小鼠体型变小(图1B)在两个雄性大鼠的整个生命周期中都保持了体重减轻(图1C)以及女性(图1D).雷帕霉素在几天内就有了效果。治疗结束后，患者体型较小，男性比女性更易受到影响。因此，治疗组的器官（脑、肝、肾和脾）的重量也减少了（图S1A）。
因为雷帕霉素最初是通过乳汁给幼崽的，所以我们研究了雷帕霉素是否直接抑制动物的生长或影响营养物质的消耗。因此，我们测试了幼崽是否食用同样数量的牛奶，以及接受治疗的动物的牛奶总蛋白是否受到影响(图1F).我们关注的是蛋白质水平，因为雷帕霉素抑制蛋白质合成(24,25).我们发现治疗组和对照组的牛奶消耗量没有差异(图1F);每一组在从母鼠中分离出来并返回再喂养后，体重增加了相同的百分比。我们进一步建造了一个定制的挤奶泵，并从水坝收集牛奶（图S2）。处理组和对照组的乳汁总蛋白质含量没有差异(图1G).我们的结论是，观察到的生长模式的影响是雷帕霉素治疗的直接后果，而不是营养缺陷。
生长通常伴随着性成熟的时间。为了测试艾尔-雷帕霉素治疗是否不仅降低了身体生长，而且降低了性成熟时的年龄，我们建立了治疗组和未治疗组年龄匹配的UMHET3小鼠（46-49天大的雌性和47天大的雄性）的繁育对，并记录了雌鼠生第一、第二胎的日期，第三胎以及出生的幼崽数量。治疗组和未治疗组小鼠的产仔数相同(图1H).然而，经过处理的育种者平均比未经处理的育种者晚产4.6天(P=0.036）。在雷帕霉素治疗的小鼠中，第一胎和第二胎之间的时间也更长（现在是9.6天，P=0.05），第二胎和第三胎之间的周期没有统计学意义(P=0.5）雷帕霉素处理的育种家(图1I).
在小鼠发育过程中给予雷帕霉素治疗可延长小鼠寿命和健康寿命
我们发现，雷帕霉素治疗可使UMHET3小鼠的中位寿命延长10%(P=0.036；图2A).这种影响主要是由于治疗对男性的影响(P=0.0064，平均寿命延长11.8%；图2B)而雌性则没有活得更长(P=0.55；图2C).
图2在发育过程中使用雷帕霉素可以延长UMHET3小鼠的寿命。
(A)治疗和未治疗的UMHET3小鼠的生存曲线，性别组合。(B和C)（B）雄性和（C）雌性UMHET3小鼠从出生到45天的存活曲线，这些小鼠以雷帕霉素或包封材料作为对照。P用log-rank检验计算值。
在查看器中打开为了了解EL治疗小鼠的健康寿命是否也得到了改善，我们测量了虚弱指数(26–28)年龄在20至29个月时，步速、血糖和胰岛素耐受性。虚弱指数是基于对小鼠年龄相关特征的无创性评估，对小鼠整体脆弱性的31个参数进行评估(26–28).雷帕霉素治疗使小鼠的虚弱程度低于对照组[重复测量方差分析（ANOVA）]，P=0.037；图3A]，我们观察到男性和女性的虚弱指数得分较低，但没有统计学意义(图3B).我们进一步应用了脆弱指数时钟(26)这项研究基于虚弱评分特征预测小鼠的存活率，并考虑到小鼠的年龄，发现用艾尔雷帕霉素治疗的小鼠的预测生存时间更长（根据性别调整的协方差分析，P=0.015；图3C).我们的结论是，雷帕霉素治疗延迟了虚弱表型的发生，包括与小鼠存活相关的特征。特征分析显示，治疗组的前肢握力、步态障碍、身体状况评分和腹胀得到改善（图S3A）。
图3雷帕霉素在发育过程中的治疗延长了小鼠的健康寿命。
(A)从出生到45天，20-29个月大的UMHET3小鼠被喂食含有雷帕霉素或胶囊材料（eudragit）的食物，其虚弱指数得分。P用重复测量方差分析（ANOVA）检验计算值。(B)从出生到45天，20至29个月大的雄性（M）和雌性（F）UMHET3小鼠接受雷帕霉素或对照饲料的虚弱指数评分。P用重复测量方差分析法计算。(C)根据使用恐惧（虚弱和死亡分析）时钟计算的虚弱指数预测生存率（以月为单位）。(D)小鼠步态速度测量方案。(E)老鼠到达终点的中间时间（秒）。P用重复测量方差分析法计算。(F和G)（F）雌性和（G）雄性的葡萄糖耐量试验结果（G）(n=每组4至6个性别）。胰岛素耐量试验结果(H)女性和(我)雄性(n=每组4至6个性别）。P数值计算采用重复测量方差分析检验。(J和K)葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验曲线下面积（AUC）。P数值是用单尾学生的t测试。
在查看器中打开我们进一步开发并应用了一种新的测试来评估老鼠的活动能力，这种测试不需要特定的设备，可以通过手机和一个普通的应用程序来进行(图3D).这种测试可以在室内设施中进行，成本几乎为零。在这个实验中，老鼠被放在笼子的一端，让它们自愿跑到笼子的另一端(图3D).完成的时间是由照片完成应用程序决定的。我们发现老鼠随着年龄的增长跑得慢得多（图S3B）。我们进一步证实，我们的测试结果可与广泛使用的评估肌肉功能的测试相比较。因此，我们在同一组27个月大的老鼠身上进行了三项测试：旋转木马、跑步机和这里介绍的步态速度分析。我们发现我们的测试和跑步机以及旋转木马之间有显著的相关性（图S4，C和D）。雷帕霉素减弱了老年男性的这种表型(图3E)这表明，作为干预的结果，这些动物的活动适应能力得到了更好的保存。
此外，我们还分析了我们的EL干预是否会影响老年动物的代谢健康，是否会导致类似于急性雷帕霉素治疗的葡萄糖不耐受。糖耐量和胰岛素耐量试验显示，接受治疗的老年男性的葡萄糖和胰岛素耐量有一些性别特异性的改善(图3，F至K)与治疗对寿命的性别特异性相一致。
目的：检测雷帕霉素是否与急性雷帕霉素治疗相似，引起高脂血症(29)我们对20至22个月大的男性和女性雷帕霉素组的肝脏和血清进行了脂质组学分析。血清中检测到3093种脂类，肝脏中检测到3075种。EL-rapamycin对两种组织的脂质含量的影响有限，我们观察到女性肝脏的大部分变化，其中95种脂质水平升高，73种脂质水平下降（表S5）。总的来说，水平升高的脂质数量与水平下降的脂质数量相当，没有偏向于甘油三酯水平的升高，这是高脂血症的特征（图S7，A和B）。另外，基因表达项目1在治疗动物中保持不变（图S7C）；项目1对雷帕霉素急性治疗引起的高脂血症有调节作用(30).
与成年时使用的雷帕霉素不同，EL-rapamycin并没有上调年轻动物肝脏糖异生途径的基因（G6Pase编码G6pc和G6pc3型，PEPCK编码人Pck1和Pck2和PGC-1α编码Ppargc1a公司)（图S7D）。这一发现表明，雷帕霉素对葡萄糖代谢的影响不同于雷帕霉素在成年后的作用。
我们进一步分析了治疗组和对照组20至29个月大的动物脾脏和骨髓的免疫细胞组成。我们先前建立了新的免疫系统年龄相关表型，这些表型可以预测小鼠寿命和淋巴瘤发病率[增加的B细胞大小、克隆B细胞、年龄相关B细胞（abc）和髓系偏倚](31).对对照组小鼠的分析显示，UMHET3小鼠与C57BL/6小鼠具有相同的年龄相关表型（B细胞大小增加、髓样倾斜、年龄相关克隆B细胞和abc的积累）。我们发现，与对照组相比，治疗组小鼠的这些表型（图S4、A、B、D和E）以及造血干细胞的百分比（图S4C）和细胞大小（图S4F）没有受到影响。
最后，对自然死亡的老年小鼠的尸检分析显示，常见的小鼠年龄相关疾病的发病率没有差异（表S1），这表明，雷帕霉素治疗的长寿效应不能归因于对特定年龄相关疾病的预防。
雷帕霉素治疗诱导促长寿基因表达的变化，这种变化是以性别特异的方式随着年龄的增长而保留的
为了深入了解雷帕霉素方案的分子机制，我们分析了年轻（2个月）、中年（20-22个月）和老年（28-29个月）小鼠肝脏和肾脏中基因表达的变化。我们首先发现，治疗引发的差异表达基因（DEGs）的数量随着年龄的增长而减少(图4A).然后，我们比较了对雷帕霉素反应的转录组变化与已知长寿干预措施和衰老诱导的转录组变化（即比较基因表达特征）(32).在雄性和雌性大鼠中，EL-rapamycin引发的年轻肝脏转录组变化与该器官的年龄相关变化相反，与长寿干预措施（终生雷帕霉素和生长激素缺乏症）引起的转录组变化相似(图4C).在男性中，与衰老特征的负相关贯穿一生；然而，在女性中，治疗效果随着时间的推移而消失(图4C).在男性和女性中，随着年龄的增长，EL-rapamycin效应与终生雷帕霉素治疗效果之间的正相关关系消失；在停止治疗后的几天内，幼年动物的这种反应最强（图S5C）。这表明，一旦终止治疗，雷帕霉素对肝脏转录组的影响会随着时间的推移而减弱。然而，在治疗过的雄性小鼠中，转录体的其他抗衰老和促长寿作用被保留下来。这得到了与肝脏衰老特征负相关和与具有较高中位和最大寿命（中位和最大寿命特征）的小鼠基因表达生物标志物的正相关支持(图4C).治疗的性别特异性寿命和健康寿命效应反映在肝脏基因表达的变化上。特别是，从治疗中受益最多的男性在不同年龄段与衰老特征之间保持负相关。另一方面，接受治疗的女性在老年时与衰老特征呈正相关。
图4雷帕霉素在发育过程中的治疗可以减缓年轻动物转录组和DNA甲基化（DNAm）的老化，雄性动物在整个生命周期中都会保存这些年轻的转录组。
(A)年轻、中年和老年用艾拉帕霉素治疗的动物肝脏和肾脏中的差异表达基因（DEGs）数量[错误发现率（FDR）<0.1]并与对照组进行比较。(B)在年轻（红色）、中年（绿色）和老年（蓝色）动物中，由艾尔-雷帕霉素引起的基因表达变化与雄性（顶部图）和雌性（底部图）衰老和寿命延长的特征之间的关联。干预特征包括个体干预的基因特征[热量限制（CR）、生长激素（GH）缺乏和雷帕霉素]、不同干预措施之间的共同基因表达特征（常见），以及与干预措施对最大或中位寿命（最大和中位寿命）影响相关的特征.衰老特征包括人类、小鼠和大鼠（人、鼠和大鼠）不同组织中与年龄相关的基因表达变化，以及肝脏和大脑特定的变化（肝脏、大脑）。(C)通过肝脏表观遗传衰老时钟估计年轻、中年和老年治疗和未治疗动物肝脏的DNAm年龄。P值是用双尾学生的t测试。(D)使用年轻治疗动物肝脏和肾脏中的等级DEGs从KEGG数据库中获取路径的GSEA。仅显示至少两种情况下的显著富集（FDR<0.1）。根据标准化富集分数（NES）对点进行着色，并根据?日志10属于P价值观。(E)使用分级差异表达和(F)治疗动物的差异甲基化基因。仅显示至少两种情况下的显著富集（FDR<0.1）。点的颜色根据NES和大小?日志10属于P价值观。
扩展以获取更多在查看器中打开基于分子特征数据库（MSigDB）的途径基因集富集分析（GSEA）显示，幼年动物对治疗反应上调代谢途径和下调炎症途径(图5D).这些变化与其他长寿干预措施一致，包括成年时的雷帕霉素、热量限制、生长激素缺乏症和异慢性抛物体病（图S5，A和B），与年龄相关的变化相反。与寿命和健康的益处相一致，我们观察到转录体的性别特异性影响。首先，与女性不同，接受治疗的男性保持了炎症通路随年龄增长的下调(图4E).其次，年轻男性比年轻女性更强烈地上调代谢途径(图4E).
图5在发育过程中接受雷帕霉素治疗可延长寿命，并缩小大型水蚤.
(A)代表性图片D、 麦格纳雷帕霉素暴露后12至14天。图中还显示了同一年龄段的对照动物。(B)水蚤第14-16天、第59-63天和第81-83天的体型测量。P使用双面学生的t测试。数据为平均值±标准差。克鲁斯卡-沃利斯试验(*P<0.05**P<0.01***P<0.001****P<0.0001）。n、 不重要。(C)对照组和三种不同浓度雷帕霉素的生存曲线（对照组，n=379；0.01牛米，n=107；1牛米，n=97；0.1纳米，n=63）。
在查看器中打开我们进一步比较了肝脏和肾脏治疗引起的基因表达变化。雄性大鼠肝脏和肾脏对雷帕霉素的反应上调核糖体基因，而女性的肝脏和肾脏则下调这些基因(图4D以及表S3和S4）。在雄性和雌性肾脏中，干扰素-γ和炎症反应途径在两种组织中持续下调，这表明雷帕霉素的一些作用可能是通过炎症的全身效应介导的（图S5D）。
总的来说，我们发现雷帕霉素治疗最初引发的基因表达变化与有效的长寿干预措施相似，与年龄相关的变化相反，男性在整个生命周期中更好地保持这些影响。然而，女性在老年时失去了与衰老特征的负相关，这与艾尔拉帕霉素治疗对寿命和健康寿命的性别特异性影响一致。而且，老年男性和女性的基因表达水平之间没有相关性（Spearman相关系数，r=?0.02），进一步揭示了雷帕霉素对老年动物基因表达影响的性别特异性（图S5、E和F）。
雷帕霉素对小鼠肝脏DNA甲基化模式的影响
为了测试表观基因在EL-rapamycin长期作用中的潜在作用，我们对肝脏进行了DNA甲基化（DNAm）分析，并用RNA测序进行了分析。治疗显著影响83个CpG位点[错误发现率（FDR）<0.1]，与动物的年龄和性别无关（表S2）。我们进一步进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）对携带不同甲基化CpG位点和差异表达的基因的富集。年轻动物体内的这些基因在类固醇、甲状腺和激素生物合成中显著丰富（图S6）。这一发现表明，雷帕霉素通过改变其DNAm模式来调节激素生物合成相关基因的表达。这与治疗对身体大小和性别特异性影响的变化是一致的。
然后我们使用pan组织和肝脏特异性表观遗传衰老小鼠时钟来估计肝脏的DNAm年龄。艾尔-雷帕霉素治疗最初降低了雌雄幼兽肝脏的表观遗传年龄，但这种效应随着年龄的增长而消失(图4C).年轻、中年和老年治疗的男性和女性的差异甲基化区域的富集显示了数量有限的富集途径，这些途径在治疗后发生了变化，并且在两性的整个生命周期中都得以保留(图4F).此外，CpG在年龄和性别之间的相关性相对较高，仅在年轻男性和年轻女性之间（Spearman相关系数，r=0.12），在老年男性和中年男性之间(r=0.15）（图S5F）。
雷帕霉素在发育过程中的治疗延长了大型水蚤
为了了解雷帕霉素治疗是否通过进化保守的长寿机制起作用，我们以无脊椎动物为模型D、 麦格纳只有在出生后发育期间才服用雷帕霉素。我们选择了从第3天和第4天到第11天和第12天的时间窗口，因为大多数动物在第12天开始生产后代(33).
像老鼠一样，艾尔雷帕霉素治疗水蚤体积更小，而且效果是剂量依赖性的(图5，A和B).而用1和10纳米雷帕霉素治疗的动物在整个生命周期中都保持较小的体型，水蚤用0.1nM雷帕霉素治疗后，随着年龄的增长，他们的大小逐渐变大，到83天时，与对照组没有显著差异(图5B，对）。尽管这些动物在体型上赶上了，但仍然活得更长，这表明在整个生命周期中保持身材矮小并不是治疗长寿的必要条件。
超过10μM的浓度被发现是有毒的，因此没有进一步研究。我们没有观察到0.1μM雷帕霉素对寿命的显著影响（χ2=1.505和P=0.220）。然后，我们检查了三种低剂量的雷帕霉素（10、1和0.1 nM）对寿命的影响，发现三种情况下的寿命都显著延长（对照组与10 nM：χ2=22.72和P<0.0001；对照组与1nm：χ2=16.23和P<0.0001；对照组与0.1nM组比较：χ2=18.67和P在对数秩检验中<0.0001）(图5C).
讨论
在这项研究中，我们证明了在出生后的发育过程中使用雷帕霉素可以延长寿命，这与进化上遥远的模式生物小鼠和无脊椎动物的生长发育延迟有关水蚤因为许多以生长途径和体型为目标的长寿干预措施与物种内的寿命成反比，我们的研究结果提供了第一个证据，证明减缓mTOR介导的生长可以延长寿命。
有很多证据表明，暴露在电致发光环境中可能会影响到进化距离遥远的生物体的衰老和寿命。例如，在拥挤的窝窝模型中，获得较少营养的幼鼠寿命更长，尽管其机制尚不清楚(34).也有一些极端情况下，通过改变昆虫发育过程中的饮食来延长寿命。在发育过程中喂养蜂王浆的蜜蜂变成蜂王，寿命是未经处理的工蜂的两倍多(35,36).同时也有报道称，在发育早期，活性氧的自然增加可以延长其寿命秀丽隐杆线虫根据H3K4me3标记(37).这些发现在小鼠身上得到了进一步证实，在小鼠发育过程中有条件地敲除Sod2可提高成年动物对随后氧化剂攻击的抵抗力(38).然而，以前的研究都没有涉及到药物干预，这使得对潜在机制的解释变得困难。在出生后的发育过程中，暴露于雷帕霉素（一种mTOR抑制剂）会延长寿命，并抑制两种进化上相距遥远的有机体的生长，这一事实支持了mTOR是生物体生长的关键基因，它介导了生长速度和寿命之间的关系。然而，雷帕霉素也有影响生长和细胞分裂的靶点，例如，人类细胞中的信号转导和转录激活因子3和c-MYC(39).未来的研究可能会测试mTOR缺陷小鼠是否对EL-rapamycin方案的反应与野生动物相似。
EL暴露转化为长寿表型的方式尚不清楚。一种可能是治疗组织的表观遗传记忆由改变的染色质结构和DNAm支持。在我们的分析中，经过治疗的动物一直到老年，肝脏中的DNAm几乎没有变化。然而，有可能的是，EL-rapamycin治疗对染色质结构有长期的影响，而不是DNAm，正如最近在活体小鼠肠道中所显示的那样(40).另外，非肝脏的组织（这里分析）可能参与了艾尔-雷帕霉素治疗的表观遗传记忆。
也有可能在EL期间，寿命机制的增强足以在以后的生命中减弱衰老表型。基因表达特征和DNAm时钟都显示了EL-rapamycin对幼年动物寿命的影响最强，而这些影响大多在生命后期消失。驾驶员体细胞突变可能在年轻时发生，并在晚年演变成一种全面的癌症(41).EL治疗可以预防或延缓体细胞突变的出现，从而导致与年龄相关的克隆扩展和癌症的延迟。另一种解释可能涉及蛋白质稳态的改善。核孔复合体和组蛋白是在生命早期合成并在非复制组织中保存的蛋白质的例子(42,43).同时，最近有一个发现，雷帕霉素可以提高体外翻译的精确度(44).雷帕霉素治疗可以减少长寿命蛋白质的翻译错误数量，并改善其在整个生命周期中的累积功能，即使在年轻时给予短暂的治疗也是如此。未来的研究可能会测试艾尔-雷帕霉素是否在体内起作用。另一个解释艾尔-雷帕霉素对长寿的好处可能是应激和损伤反应相关通路的短暂激活。在发育过程中诱导的活性氧的瞬时增加和有丝分裂前期与小鼠对氧化应激反应的改善和在C、 挽歌(37,38).在我们的基因表达数据中，外源性代谢和过氧化物酶体在年轻男性中被EL-rapamycin上调，这进一步表明，雷帕霉素在发育过程中激活应激反应，可以为以后的寿命带来益处。
虽然我们观察到在使用艾尔-雷帕霉素后，体型明显缩小，但其影响比生长激素途径缺乏的侏儒小鼠模型通常观察到的要小。如果寿命与体型的影响大小成线性关系，那么这就可以部分解释为什么我们的研究中寿命效应比矮小小鼠小（10%对40%矮小小鼠）(10,11,16).未来的研究可能会测试更高剂量的雷帕霉素是否会更强烈地阻碍发育，从而进一步延长寿命。此外，我们的研究使用了遗传异质性小鼠，而矮小小鼠的寿命研究是在近交系背景下进行的，这也可能解释了效应大小的一些差异。
雷帕霉素对寿命的影响也小于拥挤产仔实验（中位寿命增加16%）(34)它也测试了EL暴露对小鼠寿命的影响。在寿命延长方面，来自拥挤幼崽的雌性比雄性受益更多。这一发现与我们的研究不同，我们的研究中只有男性的寿命延长。这一差异可能是由于拥挤的窝窝中幼犬获得较少的营养和EL-rapamycin的作用机制不同造成的，后者在治疗组和对照组中的幼崽摄入相同量的牛奶。
雷帕霉素的长寿效应偏向男性，而在成年期和老年期给予雷帕霉素的女性寿命比男性长(19,21).长寿干预措施在不同的时间段可能有不同的效果，例如，限制热量摄入不能延长寿命，如果从老年开始(45)生长激素受体在成年动物中的条件敲除只延长雌性动物的最大寿命(18).需要进一步的研究来澄清这一现象。
艾尔-雷帕霉素的性别特异性效应与先前使用生长操纵法测量寿命的研究一致。与雄性小鼠不同，雌性小鼠在成年期受益于生长激素受体的有条件敲除(18).这表明，生长激素受体敲除对女性寿命的好处是EL和晚年效应的结合，但只有EL暴露对男性寿命有影响。同样，生长激素缺乏的男性比女性对EL生长激素疗法的反应更强烈(16).对这些影响的一种解释可能是，女性天生体型较小，因此，生长迟缓对其表型的影响较小。我们发现，雷帕霉素对雄性小鼠的生长影响大于雌性小鼠。另一种解释可能是生长控制、性别和寿命的分子机制之间的一种重要关系。在这项研究中，我们发现，接受治疗的女性起初会减少炎症途径，但在以后的生活中会激活它们。这表明女性在年老时积极地获得有害功能，同时在治疗后失去了促进长寿的作用。最后，在小鼠实验中，只测试一种剂量的雷帕霉素。然而，我们水蚤实验表明，低剂量的雷帕霉素与高剂量的雷帕霉素一样有益，但最高浓度的雷帕霉素是有害的。未来的研究可能会探讨雷帕霉素对小鼠寿命的剂量效应。
材料和方法
动物
CByB6F1/J雌性和C3D2F1/J雄性小鼠从杰克逊实验室购买。每天建立和监测育种对。在出生当天，雄性大鼠从笼子里取出，给母鼠注射5053日粮中含有相同浓度的雷帕霉素胶囊（42 ppm活性化合物）或包封材料优曲吉特（雷帕霉素控股公司），并随意喂养至45天。然后，所有的老鼠都要接受一个5053的常规饮食（试验饮食），并一直跟踪到死亡或垂死状态。死于搏斗的老鼠被排除在生存分析之外。横断面研究的动物用一氧化碳安乐死2.取脾脏并储存在冷磷酸盐缓冲盐水中，直到分析，肝脏样本立即在液氮中冷冻并储存在?80摄氏度。所有使用小鼠的实验都是按照实验动物使用的机构指南进行的，并得到了布里格姆妇女医院和哈佛医学院动物护理和使用委员会的批准。
食物消费和牛奶收集
为了计算幼鼠的食物消耗量，将7日龄幼崽与母鼠分离6小时；对幼崽进行称重，返回母鼠1.5小时，然后再次称重。幼犬再喂养后体重的变化可作为摄食量的一个指标。在幼崽9和14天大的时候，从母鼠身上收集乳汁。在电动吸乳器（Toogel）的基础上，设计了一种定制的小鼠挤奶机。用3.5%异氟烷麻醉母鼠，置于加热垫上，腹腔注射100μl 2iu催产素（Sigma-Aldrich）于无菌盐水中，以刺激产奶。然后将牛奶（50至100μl）收集到微管中并在?80摄氏度。用Qubit蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。
RNA测序
按照制造商的说明，使用Direct zol RNA Miniprep试剂盒（Zimo）从snap冷冻肝脏中提取总RNA。用50μl无核糖核酸酶的水洗脱RNA。RNA浓度用Qubit用RNA-HS试剂盒测定。根据TruSeq链mRNA样品制备指南，用TruSeq链mRNA LT样品制备试剂盒制备文库。使用生物分析仪（安捷伦）对文库进行量化，并使用Illumina NovaSeq6000 S4（2×150个碱基对）进行测序，以获得每个样本20 M的读取深度覆盖范围。使用Illumina包bcl2fastq将BCL（二进制基调用）文件转换为FASTQ。将Fastq文件映射到mm10（GRCm38.p6）小鼠基因组，用starv2.7.2b获得基因计数(46).基因表达的统计分析用来自R的DEseq2 3.13和edgeR 3.34.1的定制模型进行（结果DEG列表见表S3）(47).对于GSEA，每个基因的等级计算如下?日志10(P值）如果对数折数变化为正，则乘以1?如果为负数，则为1。GSEA是用R中的clusterprofiler包执行的(48).为了进行特征关联分析和寿命相关基因的鉴定，我们筛选出读数较少的基因，在至少50%的样本中只保留至少10个读数的基因，根据Entrez注释，结果检测到12374个基因。
虚弱指数
虚弱指数的测量如中所述(26);根据原始方案计算虚弱指数得分，并进行小幅度修改。由于雷帕霉素治疗的小鼠明显小于对照组，因此体重和体温的sd_评分根据各组年轻动物的平均值独立计算。因此，我们避免了这些参数的偏差，因为各组之间的体型差异。
步态速度
老鼠被安置在一头有自由空间，另一端有食物容器的普通老鼠笼里。记录从SprinTimer应用程序（appstore）开始，在应用程序发出“GO”信号后，让老鼠自愿跑到笼子的另一端。在绝大多数情况下，老鼠跑向食物容器，大概是为了躲起来。终点线用笼子末端的彩色胶带标出。当老鼠到达终点线时，停止记录，并根据应用程序中的图片量化完成的时间。完成时间被确定为老鼠鼻子越过终点线的时间。让每只老鼠跑四次，记录中位数。如果老鼠在跑步过程中没有站立或旋转90°或更大角度越过终点线，则认为尝试成功。如果老鼠在15秒内跑不完，记录15秒。
葡萄糖和胰岛素耐受试验
在葡萄糖耐量试验中，小鼠被放在无食物的笼子里16小时（通常从晚上7点到第二天上午11点）。第二天，给小鼠称重、标记，并从尾部出血，用血糖计测量空腹血糖水平。将过滤后的10%葡萄糖注入无菌生理盐水（Sigma-Aldrich）中，最终剂量为1mg/kg体重。在小鼠之间每隔30秒注射一次。在注射后20、40、60和120分钟，每隔30秒再次测量血糖水平。同样进行胰岛素耐受试验，但小鼠禁食6小时（通常从上午10:00到下午4:00），并注射胰岛素（0.75 U/kg；礼来）在无菌盐水溶液（Sigma-Aldrich）中。
DNA甲基化
我们用最近开发的哺乳动物甲基化阵列（Horvathmammalmethchip40）分析了从肝脏分离的DNA样本(49).在我们的分析中使用了两个时钟，其中一个基于小鼠肝脏（肝脏）的时钟，另一个是基于pan组织的时钟（pan）(50).学生的双尾t检验用于统计学检验。对于GSEA，每个CpG站点的第一等级计算如下?日志10(P值）如果对数折数变化为正，则乘以1?如果为负数，则为1。然后，按基因名进行等级聚合，计算每个基因的平均秩值。为了比较起见，只有在差异表达分析中包含的基因才被纳入DNAm-GSEA。对于GO和KEGG富集，具有位点的基因因处理而显著改变(P<0.05）与DEGs重叠(P<0.05），并使用clusterprofiler软件包的enrichGO和enrichKEGG函数，以微阵列检测到的所有基因为背景，对重叠基因进行富集分析。
水蚤存活
D、 麦格纳动物被用于水蚤寿命测定。从瑞士巴塞尔大学的埃伯特实验室获得了一个IL-MI-8耐热克隆，该克隆来自以色列耶路撒冷的一个池塘。为了收集同步队列，将出生于1-2天的新生儿与母亲分开，在第8-10天确定其性别。所有母亲在相同的条件下（25°C）喂养和培养。在这项研究中，我们所有的实验都使用女性。药物治疗后，将40至50只动物随机分配到我们开发的培养罐中(51).所有培养物（例如母亲、新生儿和水箱培养物）都保存在亚当水里(52)在25°C的培养箱中，暴露在16个光小时后8个黑暗小时的光周期中，每天喂绿藻悬浮液，斜斑，浓度为105细胞/ml（对于一只动物/20ml密度，按人口比例分配的食物量）。每隔6天，换一次水，人工将后代移走，直到将动物转移到培养平台上。culture platform操作协议的细节与先前发布的协议中的类似(51).
单调的工作
小鼠被放置在跑步机的一条车道上，并被要求跑至筋疲力尽（不超过15分钟）；这次被记录下来了。老鼠被强迫在跑步机的一端使用一个震动线圈（频率设置为4赫兹，强度为1毫安），如果他们把自己抬到跑步机的一端，这些动物就能感觉到。一个早期的终点是当老鼠变得如此疲劳以至于他们选择被电击而不是在跑步机上跑步。这是在老鼠闲置5秒后，将老鼠从跑步机上移开并让其休息的情况下确定的，跑步机速度设定为7.5米/分钟。
旋转法
将小鼠置于旋转木马装置上最多15分钟。在试验期间，小鼠在旋转木马上行走并保持平衡。试验前，小鼠以8rpm的转速驯化5min，静置1小时，以2rpm的起始转速，以2rpm/s的加速度进行试验。每只老鼠测试一次。记录了坠落的时间。
脂类学
使用液相色谱-质谱（MS）系统对极性和非极性脂类进行分析，该系统由岛津Nexera X2 U-HPLC（岛津公司）和Exactive Plus orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）组成。使用Qiagen组织分析仪以1:20质量体积比（mg/μl）在1:20（v/v）的水：异丙醇溶液中均匀化肝脏。在20赫兹下均质4分钟后，匀浆在10000 rcf（相对离心力）下离心10分钟前培养1小时。注入上清液（2μl）进行分析。血清样本（10μl）提取用于脂质分析，使用190μl含1,2-二脱氧甘油-3-磷酸胆碱（Avanti极性脂质）的异丙醇作为内标。离心后，将2μl上清液直接注入100 mm×2.1 mm、1.7μm ACQUITY BEH C8柱（水）。用80%流动相A（95:5:0.1 v/v/v 10 mM醋酸铵/甲醇/甲酸）等比例洗脱1 min，然后在2 min内与80%流动相B（99.9:0.1 v/v甲醇/甲酸）线性梯度洗脱，7 min后线性梯度至100%流动相B，然后在100%流动相B下3 min。质谱分析采用正离子模式下的电喷雾电离，在70000分辨率和3-Hz数据采集率下，使用200-1100质量/电荷比进行全扫描分析。其他MS设置如下：鞘气，50；在源碰撞诱导的离解中，5ev；扫气，5；喷雾电压，3kV；毛细管温度，300°C；S-镜头射频，60；加热器温度，300°C；微扫描，1；自动增益控制目标，16;最大离子时间，100毫秒。原始数据处理使用TraceFinder软件（Thermo Fisher Scientific）进行目标峰积分和人工审查已识别脂质子集，并使用Progenesis QI（非线性动力学）进行峰值检测和已知和未知脂质的积分。在与参考血浆提取物进行比较的基础上确定脂质特性，用脂酰链中碳的总数和脂酰链中双键的总数来表示。
