合成生物学丨地衣型真菌次级代谢产物新研究

【字体: 时间:2022年09月13日 来源:基因有限公司

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  PacBio HiFi长读长测序结合生物信息学的方法鉴定出地衣型真菌活性天然产物——三苔色酸(Gyrophoric Acid,GA)的生物基因合成簇(biosynthetic gene clusters,BGCs),为工业上以合成生物学的角度生产和改造GA的途径提供了必要的信息。

PacBio HiFi长读长测序结合生物信息学的方法鉴定出地衣型真菌活性天然产物——三苔色酸(Gyrophoric Acid,GA)的生物基因合成簇(biosynthetic gene clusters,BGCs),为工业上以合成生物学的角度生产和改造GA的途径提供了必要的信息。

合成生物学中微生物次级代谢产物基因组挖掘的流程一般包括四步:

1.对目标样本进行基因组测序。
2.通过生物信息学分析预测潜在的BGCs。
3.利用分子生物学的手段激活BGCs中的沉默基因簇,使其表达形成相应的次级代谢产物。
4.通过液相色谱、核磁共振、质谱或紫外等多种方法对次级代谢产物进行结构表征和活性评估,筛选出有成药潜质的化合物再进行进一步的研究。

而对目标样本进行基因组测序是第一步,也是完成整体方案的先决步骤,获得目标样本准确且完整的基因组信息是至关重要的。PacBio HiFi长读长测序如何在此步骤中应用?PacBio HiFi的技术原理和优势有哪些?我们通过PacBio HiFi在地衣型真菌次级代谢产物的新研究来解答以上两个问题。2022年7月份发表在ASM杂志上题为A Candidate Gene Cluster for the Bioactive Natural Product Gyrophoric Acid in Lichen-Forming Fungi的文章利用PacBio HiFi长读长测序组装了15个高质量的地衣型真菌三苔色酸(GA)的基因组,分析得出共涉及9个石耳属(Umbilicaria)地衣型真菌;发现石耳属真菌GA基因组结构呈多种类型,发现有三个保守基因,其中包括经典的聚酮合酶(polyketide synthas,PKS)基因,并首次鉴定出三缩酚酸类PKS。

测序策略

样本选择:

作者收集了8种石耳属物种U.deusta, U.freyi, U.grisea, U.subpolyphylla, U.hispanica, U.phaea, U.pustulata, U.spodochro.

DNA提取,文库制备,基因组测序:

1.使用无菌水清洗地衣菌体,并在立体显微镜下检查是否存在可能的污染和其他地衣菌体。
2.使用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取DNA。
3.按照low DNA input protocol构建文库。DNA起始量为170-800ng。
4.使用Sequel system II 平台基于CCS模式进行测序,每个宏基因组文库使用一张SMRT芯片进行测序。

高质量基因组

基于PacBio HiFi测序技术组装了15条高质量的基因组,完整性高达85.9%—99.6%(Table1)。在15个石耳属基因组中共鉴定到406个生物合成基因簇(BGCs)和236个聚酮合酶(PKS)。

Table 1 基因组质量和注释信息

Table 2 石耳属菌株中生物合成基因簇和PKS的鉴定

U.deusta GA中共鉴定到15个基因(图1A)。通过antiSMASH鉴定到PKS和cyt P450两个基因;通过NCBI CDS鉴定到GA中的10个候选基因并推测相应的功能。其中PKS基因簇长为6372bp,通过PacBio HiFi测序技术可以获得完整的基因簇信息(图1)。

图1.(A)通过使用antiSMASH预测U.deusta中的三苔色酸。有颜色的箭头框代表基因。灰色箭头框代表无法确定基因编码蛋白的基因(通过antiSMASH推测)。(B)推测的三苔色酸基因的功能(通过InterProScan and NCBI CDS search预测)

作者在文中提及到将PacBio HiFi长读长测序技术与生物信息学结合进行基因组的挖掘,这种技术手段的发展不仅可以实现生物合成基因和天然产物的连接,还可以提供基因组中基因簇的成分和结构的整体视野分析。

HiFi 测序是PacBio测序平台推出的兼顾长读长和高准确度的测序技术。作为PacBio最新的数据类型,既兼顾读长(10-25kb)又具有高准确度(>99.9%准确率)的HiFi reads,不仅在合成生物学中基因组的挖掘应用中有着不错的表现,还可以实现全长16s rRNA测序,以更高的分辨率定义微生物种级别分类,构建完整的宏基因组组装基因组(MAGs)实现微生物与环境关系的分析,同时可以更准确的定义出功能基因,以便进一步的分析。

参考文献:A Candidate Gene Cluster for the Bioactive Natural Product Gyrophoric Acid in Lichen-Forming Fungi
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.00109-22

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基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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