暨南大学张弓教授：剪切变体的蛋白质鉴定

　　

暨南大学张弓教授团队研发了三代全长翻译组测序技术，突破了人类蛋白质组计划的三大难题之一的剪切变体蛋白质产物鉴定，发现了人细胞中存在着数千种数据库中从未收录的mRNA剪切变体可以翻译成蛋白质，并在蛋白质层面用质谱鉴定了其中一些新剪切变体的特征肽段。这一成果打开了蛋白质组研究的新天地。日前，该成果通过了科技部的课题验收。

真核生物中广泛存在着可变剪切(alternative splicing)，即基因组上的一个基因可以通过不同的剪切方式产生多种RNA（称为“可变剪切转录本”，alternative spliced transcripts, AST），其中的一些可以被翻译为蛋白质。不同剪切变体的蛋白质产物执行不同的生物学功能，甚至功能相反，在各种生理和疾病过程中起到重要的调控作用，因而备受研究者关注。虽然二代和三代测序可以发现大量AST，但有研究表明可能超过一半的AST并不进入翻译，因此不产生蛋白质。即便是翻译成蛋白质的AST，其可能并不被数据库收录；即便被数据库收录，不同剪切变体之间的差别往往很小，只有一个肽段可以区分，传统的质谱搜库方法灵敏度不够，因而非常难找到剪切变体的特征肽段。由于存在着种种技术困难，以往的蛋白质组研究中极少涉及剪切变体的蛋白质鉴定。2012年国际人类蛋白质组计划C-HPP正式启动时，剪切变体的规模化鉴定、蛋白质修饰、蛋白酶处理的蛋白质变体，并称为人类蛋白质组计划的三大难题。

暨南大学张弓教授团队研发了三代全长翻译组测序技术，提取两株人细胞系正在翻译的全长mRNA (RNC-mRNA)，使用二代测序仪和Nanopore三代测序仪成功进行了翻译组测序RNC-seq。由于RNC-seq测的是完整的翻译中mRNA，读长不受限制，相比于ribosome profiling只能测28-30碱基的核糖体覆盖片段，RNC-seq所得信息更完整，在检测翻译中mRNA及其剪切变体的能力上完全碾压ribosome profiling，且成本低数量级。使用二代RNC-seq指导质谱数据分析，单个细胞系中可鉴定到9240种特异的蛋白质剪切变体，是迄今为止最完整的蛋白质组水平上的剪切变体鉴定。

研究者惊讶地发现，三代全长翻译组测序中鉴定到的剪切变体一大半（8954种）是二代测序用极高通量都无法鉴定到的，其中4525种剪切变体在数据库中从未被收录过，意味着这些蛋白质从未被人类注意过。甚至连GAPDH这样的高丰度看家基因，也能检测到二代测序测不到的新剪切变体。这凸显了三代全长翻译组测序的威力。以此为指导，研究者从质谱数据中找到了50个新剪切变体的蛋白质证据，并使用MRM技术进行了验证。

这一研究建立了较为稳健的、可复制和商用化的蛋白质组级别的剪切变体鉴定技术方案，拓展了人类蛋白质组的版图，让人们认识到还有大量剪切变体的蛋白质产物未被认识。鉴于剪切变体普遍具有不同的生物学功能，本研究也打开了一扇剪切变体的大门，可以预见，这些新剪切变体的功能将被逐渐揭示，其中一些可能参与重大疾病、衰老等过程的关键机制。

张弓教授是暨南大学翻译组学实验室的负责人，国家优青，国家万人计划青年拔尖人才。2022年起任国际人类蛋白质组计划C-HPP执行委员会常务委员。

 

文章：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2022.895746/full

Efficient Detection of the Alternative Spliced Human Proteome Using Translatome Sequencing