一网打尽FFPE样本制备难题

FFPE样本，即福尔马林固定石蜡包埋组织样本。在临床研究中，组织离体后，其原有的形态功能很难完整地保存，因此通过甲醛固定以及石蜡包埋的方式可以最大限度地保存样本的完整性以及生物大分子的完整性。

FFPE样本十分珍贵，每个来自临床的样本都有限且不可替代。FFPE样本为回顾性研究和指示预后提供了宝贵的资源。据统计，世界上有数十亿份FFPE样品保存在医院或者组织样品库中。

然而，在针对FFPE样本的各种实验中，如何从FFPE样本中高效地获得生物大分子的同时保证其完整性是个问题。

问题01

• 脱蜡：处理FFPE样本的第一步就是脱蜡。二甲苯脱蜡法由于其脱蜡彻底的特性被广泛地应用。但是，使用二甲苯脱蜡法也有缺陷。首先二甲苯会危害实验员健康，其次二甲苯会影响组织切片质量，若使用不当，易使组织产生收缩、硬化变脆等变化。第三，操作过程繁琐时间太长。

问题02

• 样本量少：每一个FFPE样本都是珍贵且独一无二的。在样本量有限的情况下，如何在尽可能减少损耗的同时释放其所蕴含的生物信息？

问题03

• 生物大分子得率低：福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程会进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响。这都会导致生物大分子得率低，完整性不高，质量较差，难以兼容下游qPCR、测序等应用。

Covaris解决方案

核酸提取

•Covaris基于专利自动聚焦声波技术（AFA）主动脱蜡水化，无需使用二甲苯等有机溶剂更加安全，脱蜡更彻底的同时，AFA超声帮助蛋白酶K和裂解液更有效地渗透组织，提高水化效果和大分子解离，从而提高核酸得率和质量。该方案可处理5-25μm厚的FFPE组织切片，并且可在3小时内完成从样本收集到核酸纯化一系列流程。下游无论是做qPCR、NGS，还是三代测序，都能较好地达到核酸样本制备要求。如图1所示，石蜡在358nm激发光下呈现蓝色自发荧光，经Covaris主动脱蜡的FFPE样本石蜡残留更少，消化更彻底，提高核酸质量和产量。如图2所示，不同类型FFPE样本经Covaris以及其他试剂盒脱蜡处理，纯化核酸后做qPCR结果，相同条件下，Covaris提供的方案提取的模板DNA扩增效率更高。如图3所示，FFPE样本与新鲜样本提取DNA测序覆盖度进行比较，其中横坐标表示染色体，深色为覆盖度大于10X的区域，Covaris处理的样本覆盖度更加均匀，更接近新鲜的冰冻样本。

图1.不同方法脱蜡结果比对

图2.不同方法提取FFPE样本核酸进行qPCR结果对比

图3.不同方法提取FFPE样本核酸进行测序结果对比

ChIP

• FFPE样品由于材料数量有限以及苛刻的固定过程而降低了抗原可用性，因此用于ChIP实验存在一定的难度。Covaris针对FFPE样本专门开发了试剂盒truChIP FFPE Chromatin Shearing Kit。

• 该试剂盒针对FFPE样本进行ChIP提供了标准化protocol，收集载玻片上的FFPE样本，通过Covaris进行乳化脱蜡及再水化，聚焦的 AFA 能量可以主动去除石蜡，同时进行水化，保护生物大分子不被降解的同时提高得率。最后在Covaris上进行染色质剪切，染色质剪切是ChIP实验中至关重要的一步，通过球面固态超声波发生器将声波聚焦到样本区域，能量精确可控，可将染色质片段化为300~600bp之间，片段化重复性高、剪切无偏好，片段长度分布均匀；温度恒定，保护蛋白抗原表位，提高IP和DNA回收率。仅需三步，即可高效、安全的制备FFPE样本用于ChIP。同时，可以做到全程无接触：全程操作封闭完成，仅需一步转移，简化操作流程，减少样本损失和污染。如图4所示，为操作流程。如图5所示，使用truChIP FFEP试剂盒提取FFPE样本染色质做ChIP实验，能够获得跟使用新鲜冰冻组织做ChIP实验一样的效果。这表明，FFPE组织样本提取的染色质保持了较好的完整性。

图4.FFPE样本ChIP workflow

图5.转录因子CTCF的ChIP实验。起始材料分别为FFPE组织样本（使用truChIP FFPE实验方法），和新鲜冰冻组织(FFT)。在两组ChIP实验中，850ng的染色质被CTCF抗体或者阴性对照IgG结合沉淀下来。富集倍数以IgG对照来计算确定。与阴性对照肌红蛋白基因的外显子2区域（Myoglobin Ex2）相比，H19 印记控制区域有显著富集。

蛋白组学

• 蛋白组学是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。由于FFPE特殊的样本类型，使得其蛋白组学研究也遭遇了不小的挑战。Covaris针对FFPE样本的蛋白组学开发了一系列protocol。

基于聚焦超声技术的激光显微切割(LCM) 捕获样本自动化蛋白质组学样本制备流程

• 激光显微切割(LCM)技术可以深入到组织中的单个细胞水平，从而对潜在的生物过程进行精细定位，这是更好地描述恶性转化(如癌症)的关键。这其中需要应对的挑战有：超微量的样品处理体积以及步骤繁多，损耗量大。Covaris有多种规格耗材，可以将切割获得的组织细胞直接收集在样品管中进行处理，使整个处理过程无需转移，减少了样本损耗，对微量样本十分友好。同时Covaris一站式解决主动脱蜡以及蛋白消化，让整个流程更加标准化、简单。如图6所示。

图6. FFPE样本LCM捕获蛋白组学研究方案

基于聚焦超声技术的修饰后蛋白富集与捕获方法 (APAC)为蛋白质组学提供了直接、可重复且无毒的FFPE组织样品制备方法

• 该方法完全消除了现有的依靠二甲苯脱蜡的缺点，保证了蛋白质组的分析深度、解交联效率和蛋白质丰度的动态范围，同时也提高了重复性。将FFPE样本蜡卷加入96孔板中，通过加热(95℃) 结合AFA 超声处理进行解交联同时乳化石蜡。蛋白结合在磁珠上进行纯化，后用异丙醇洗涤除去残留的石蜡。随着乳状上清液逐渐变得澄清，石蜡也被逐渐清除至完全清除。最后，在磁珠上进行胰酶消化，得到纯净的肽溶液，在 LC-MS 上机之前通过 SDB-RPS Stage Tips 对其进行脱盐如图所示。如图7所示。

图7.FFPE样本蛋白组学研究方案

画重点！

Covaris样本制备系统针对FFPE样本的一系列应用开发了一站式解决方案，无论是qPCR、测序、ChIP还是蛋白组学，都能帮助用户获得高效、稳定的生物大分子样本，进而协助用户提升下游实验的数据质量！

Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，旨在帮助研究者实现快速、稳定、高效样品的预处理。基因有限公司作为Covaris在中国的合作伙伴，为您提供DNA片段化、ChIP实验、FFPE样本核酸提取、蛋白提取等解决方案。