mRNA加帽方式有哪些?重磅新品来袭!!

【字体: 时间:2022年09月23日 来源:基因有限公司

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  本次小编要给大家特别介绍的就是NEB公司重磅推出的新产品Faustovirus病毒加帽酶(FCE),一起来看看吧。

在 mRNA 疫苗和基因功能研究中,合成的 mRNA 需要在体内完成翻译,加帽和加尾至关重要,它们能有效防止降解并促进其在真核细胞中的的翻译。

大多数真核细胞 mRNA 通过 5’→5’三磷酸键,在其 5’端第一个核苷酸上添加 7-甲基鸟苷(m7G)进行修饰。mRNA 帽结构是促进核糖体靶定到 mRNA 进行翻译的关键因子。


mRNA 5’帽结构的示意图,黄色表示 7-甲基鸟苷,
蓝色表示 mRNA 的 5’末端,红色表示 Cap 1 结构中的 2'-O-甲基

有两种方式可将帽结构添加到转录产物中:

▪ 酶学法加帽:转录完成后,通过加帽酶、GTP 和 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)进行加帽
▪ 共转录加帽:转录过程中加入帽结构类似物

对于以上两种方式,NEB均提供了高品质的加帽产品。

大家有没有发现图中亮点呢?没错,本次小编要给大家特别介绍的就是NEB公司重磅推出的新产品Faustovirus 病毒加帽酶(FCE),一起来看看吧。

产品介绍

Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)在转录产物 5′末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入 N7-甲基鸟苷帽(m7G),产生带有 Cap-0 帽的 RNA(1)。FCE 是一种单亚基酶,具有给 RNA 加 Cap-0 帽所需的三种酶活:三磷酸酶,鸟嘌呤转移酶,(鸟嘌呤-N7)-甲基转移酶。FCE 从低温至 55℃ 高温范围内,均能够维持加帽活性。一般情况下,1 µl FCE(25 units)可以在 37°C 条件 1 小时内完成>100 µg RNA 的加帽。本产品提供加帽所需的 GTP 和 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。

产品优势

▪ 有效提高加帽效率,适用于困难加帽底物
▪ 使用更少的酶即可高效加帽
▪ 反应温度范围更宽,更灵活
▪ 平移替代牛痘加帽系统(VCE),几乎无需优化
▪ Faustovirus 病毒加帽酶(FCE)与 mRNA 帽结构 2'-O-甲基转移酶协同作用,可一步加帽至 Cap-1 结构
▪ FCE 无专利费

产品特性展示

1. FCE 提高加帽效率,优化操作流程


A. 分别使用 FCE 和牛痘病毒加帽系统(VCE)在 37℃ 条件下加帽。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 7 μM),分别使用 FCE(25 units 相当于 1 pmol,在 50 μl 体系中浓度为 20 nM)或 VCE(25 units 相当于 1 pmol,在 50 μl 体系中浓度为 20 nM)37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是,上述条件低于我们推荐的酶用量,用以展示 FCE 比 VCE 的加帽效率更高,以及在流程优化上的优势。

B. 使用 FCE 分别在 37℃ 和 42℃ 条件下进行 mRNA 加帽。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 7 μM),使用 FCE(25 units 相当于 1 pmol,浓度为 20 nM)37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是,上述条件低于我们推荐的酶用量,用以展示 FCE 在流程优化上的优势。加帽反应体系为 50 μl,含有 0.1 mM SAM、0.5 mM GTP、以及用于 FCE 反应的 1X FCE 加帽缓冲液或用于 VCE 反应的 1X 加帽缓冲液。反应结束后,进行靶向 RNase H 切割,并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。

2. FCE 的 RNA 加帽反应适用于更宽泛的温度范围


分别使用 FCE 和 VCE 在 15℃-60℃ 条件下进行 RNA 加帽。20 μl 加帽反应体系中含有:2.5 μM RNA 底物(5´-三磷酸 20mer 3´-FAM)、8 nM 加帽酶、0.1 mM SAM 和 0.5 mM GTP。FCE 加帽反应在 1X FCE 加帽缓冲液中进行,VCE 加帽反应在 1X 加帽缓冲液中进行。所有反应在指定的反应温度下孵育 30 分钟。通过毛细管电泳检测反应产物。

3. FCE 可对各种 RNA 进行高效 5’加帽(50 units至少加帽 100 ug RNA)


上图展示了 FCE 对多种 mRNA 的加帽效果。以含有不同 5´-UTR 序列(如图所示)的 FLuc 转录本(共 1.77 kb)作为加帽底物(200 μg,相当于约 350 pmol,浓度为 3.5 uM),在含有 1X FCE 缓冲液的 100 μl 反应体系中加入 2 μl 的 FCE(50 units 相当于 2 pmol,浓度为 20 nM),37℃ 条件下孵育 1 小时。反应结束后,进行靶向 RNase H 切割,并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。

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