有多少肿瘤基因组分析可以重来，且看HiFi测序

林奇综合征作为一种罕见的遗传性癌症易感综合征，致病突变多样。利用HiFi长读长测序技术可以有效提升林奇综合征在遗传上的诊断率。

今天给大家介绍的是一篇2022年8月22日发表于Gastroenterology杂志（IF=33.883）的文章，Richarda M. de Voer的研究团队采用HiFi长读长测序技术提升了遗传性癌症的诊断率。

1 林奇综合征——会遗传的癌症？

1966年，癌症遗传学之父—亨利•林奇(Henry T. Lynch)对在家族中聚集的结直肠癌、子宫内膜癌等现象进行了描述。1985年，林奇将这种综合征命名为遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC）。后来人们为了纪念他，将该类家族聚集性肿瘤称为林奇综合征（Lynch syndrome，LS）。

林奇综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病，是由于DNA错配修复(mismatch repair，MMR)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2或影响EPPCAM 3’区域缺失的胚系致病性变异（pathogenic variant，PV）所引起的。其特征为易患多种癌症，不局限于结直肠癌，还包括消化道、泌尿道、肾脏、子宫内膜、卵巢、脑和前列腺的肿瘤、以及皮脂腺皮肤肿瘤，具体取决于所涉及的基因。林奇综合征具有发病早、多原发、遗传性等特点。

2 传统检测手段及问题

目前对LS的种系诊断包括对MMR基因编码区域的靶向短读长测序(targeted short-read sequencing，TSR-seq)和多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）。在MMR基因中没有胚系PV的情况下，会研究体细胞中的MMR功能缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）。然而，在经过生殖细胞和体细胞分析之后，仍然有部分dMMR肿瘤个体在遗传上未能得到确定，这些患者有不明原因的dMMR肿瘤，被称为类林奇综合征（Lynch-like syndrome ，LLS）。

传统的测序方法由于读长短，对于MMR基因不能完整覆盖，再加上Alu插入、串联重复序列甚至高度同源序列的存在，使得传统测序方法很难还原基因全貌，也不能对假基因进行分辨。这就导致一些位于非编码区域的变异丢失，而往往这些变异正是引起LS的罪魁祸首。

3 HiFi测序提升LS诊断率

由于HiFi测序技术长而准，能够跨越重复序列，且能精准分辨假基因，所以基于HiFi长读长测序技术的靶向扩增可以对MMR基因进行完整覆盖，有利于还原真实基因序列信息，揭示LS相关基因的变异全景。

测序方法

在这篇文章中，研究团队利用HiFi长读长测序技术，对LLS个体的MMR基因进行长片段PCR扩增子靶向长读长测序(targeted long-read sequencing，TLR-seq)。扩增子的设计范围为7-18kb，扩增子之间有1kb重叠。每个基因的扩增子设计如下表。

表1.各MMR基因扩增子设计

扩增子具体长度及覆盖范围如下图所示（图1）。值得注意的是，对于PMS2，在基因区域下方可见chr7上的高度同源区域（橙色部分＞99%相似度，灰色区域90%-98%相似度）。

图1.扩增子的设计

测序结果分析

对序列进行分析发现，在32名患者中，有9名出现了非编码畸变（28.1%;9/32，表1）。其中6个个体在MSH2 (n=3)、MLH1 (n=1)和PMS2 (n=1)基因中出现了五个不同的深内含子SNV，它们可能会引入新的可变剪接位点。除此之外，在MSH2的内含子1和8中发现了两个Alu元素插入(与Alu元素相似度96%)，在MLH1的内含子3中发现了一个1704 bp的内含子缺失，在MLH1启动子区域发现了一个串联重复，这些变异此前在群体数据库中均没有报道。

表2.肿瘤的免疫组化和体细胞变异体

注：红框标注为本研究中发现的变异

变异影响分析

为了探究这些新发现的非编码变异的影响，研究团队分别做了共分离、Mini-gene和荧光素酶报告实验。

测序结果显示，LLP004个体中携带有两种深内含子MSH2变异:c.793-603C>T 和 c.2458+976A>G。共分离分析表明，c.793-603C>T 不与家族内的癌症表型共分离，因此该突变不是MSH2的PV；c.2458+976A>G在其他3个患病亲属中产生了共分离。进一步对一个患病表亲的淋巴母细胞系中提取的MSH2 mRNA进行定量分析，结果显示，与对照样本相比，实验组中出现了无意义介导的衰变(nonsense-mediated decay，NMD)和MSH2表达下降(图2)。

图2.mRNA定量分析

个体LLP009中也存在同样的MSH2 c.2458+976A>G变异。对这两个个体的 c.2458+976A>G变异做了Mini-gene分析，结果表明，由于新的剪接供体位点的产生和内含子剪接受体位点的激活导致该处过早出现了终止密码子，从而导致了选择性剪接（所有Mini-gene结果见图3）。

图3.Mini-gene分析中显性表达转录本的Sanger测序结果

LLP031个体在MSH2中携带了一个顺式的Alu元素插入(c.1387-3546_1387-3545ins351)和一个深内含子变异(c.2459-954A>G)。c.2459-954A>G变异的Mini-gene分析显示，在外显子14和15之间包含一个假外显子(68bp)，导致p.(Gly820Glufs*44)处过早出现终止密码子，所以研究团队认为后者是该个体的PV。

对于个体LLP024的MSH2外显子2中的Alu元素插入(c.212-4_213-3ins366)、个体LLP032的MLH1中的深内含子变异（c.306+1001_307-642delinsTA)和个体LLP002的MLH1 中的深内含子变异（c.306+1070C>G)的Mini-gene分析表明，与野生型相比，这些变异最终导致了终止密码子的过早出现。

研究团队利用荧光素酶报告实验对LLP025 (MLH1 c.-404_-357dup)中MLH1启动子48bp串联重复序列的影响进行了评估。结果表明，与野生型MLH1启动子相比，MLH1 c.[-404_-357dup;-93G>A]单倍型的启动子活性水平相似(图4)。此外，未观察到种系MLH1启动子的高甲基化。因此，这种重复目前被认为是一种意义未知的变异。在LLP014和LLP029个体中发现的PMS2 C .2276- 400G>C深内含子变异的Mini-gene分析表明，与野生型相比，剪接没有改变。

图4.荧光素酶实验结果

结论

由此可见，有相当一部分患有LLS的个体可以被诊断为LS，因为他们携带的MMR深内含子基因畸变会导致异常剪接。在检测到非编码畸变的9个患者中，6个患者的变异属于PV。HiFi长读长测序技术可以将LS的诊断率提升19%（6/32）。

Summary

案例中，正是由于运用了基于HiFi测序的长片段PCR扩增子测序（7-18kb），才检测到了很多此前遗漏的部分。“对于没有明确遗传诊断的LLS个体，基于HiFi测序的长读测序技术可能有助于检测目前诊断方法没有涵盖的深内含子变异，同时可以检测到Alu插入或串联重复序列，这些是很难用短读长测序技术检测的。”

HiFi测序不仅可以提升遗传性肿瘤——林奇综合征的诊断率，在其他各类癌症比如说乳腺癌、白血病、头颈癌等的变异诊断上也有重要应用。并且，由于HiFi测序在单倍型分型上的独特优势，在药物基因组研究方面也越来越多的出现了HiFi的身影。未来还有多少肿瘤基因组分析可以重来？我们且看HiFi测序！

参考文献：Non-coding aberrations in mismatch repair genes underlie a substantial part of the missing heritability in Lynch syndrome
doi: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2022.08.041

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