LI-COR Odyssey在疫苗研发领域的功能解锁

【字体: 时间:2022年09月05日 来源:基因有限公司

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  In-Cell Western结合了Western blot 技术的特异性与 ELISA 技术的可复制性和通量,目前已成为研究病毒感染特性的高效、快速、可靠的实验技术。

1 背景介绍

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)感染是世界上几个地区的地方病,其他许多地方的季节性爆发风险很高。合成 DNA编码的单克隆抗体(DMAb)是一种能够在体内递送高效 mAbs 来控制感染的方法。

2019年,美国Wistar解剖&生物学研究所,疫苗&免疫治疗中心在Molecular Therapy杂志上发表了题为In Vivo Delivery of a DNA-Encoded Monoclonal Antibody Protects Non-Human primates against Zika Virus文章,该团队将DNA编码的单克隆抗体合成质粒 DMAb-ZK190 注射到小鼠和恒河猴体内,有效控制了寨卡病毒的感染,有望成为首个DNA编码的单克隆抗体治疗进入临床试验的方法。

在这篇文章中,作者利用LI-COR Odyssey 进行Western Blot,检测目的蛋白(抗原/抗体)是否表达、表达的特异性、表达量的高低以便筛选高表达株。

此外,作者还利用In-Cell Western(一种依据抗原抗体结合原理,利用目标蛋白的特异性抗体及近红外荧光染料标记的二抗,在96孔板或384孔板培养的细胞上原位对目标蛋白进行定量分析的技术),进行了中和实验,分析动物血清中抗体影响病毒感染细胞的情况。

2 结果展示

作者利用Western Blot实验验证DMAb-ZK190和DMAb-ZK190-LALA编码的单克隆抗体是否与Zika病毒E蛋白结合。向C57BL/6小鼠注射200mg ZK190(A)或者ZK190 LALA(B)质粒,对注射有ZK190(A)或者ZK190 LALA(B)小鼠的血清样品评估,以确认ZK190单克隆抗体与Zika病毒E蛋白的结合Western blots were cropped for clarity (white bar) (E and F) 。来自(g) dmabzk190注射的和(h) dmab-zk190 lala 小鼠的第7天血清的连续稀释在基于流动的测定中体外评估其阻断 zikv h/pf/2013(100pfu) Vero 细胞的感染的能力。将蛋白质 zk190单抗或 zk190 lala 单抗包括在对照中。用线性回归分析法测定血清中 dmab 的浓度,与只接受病毒的孔相比,血清中和了50% 的感染。对于每个实验,“ n”指的是生物学上的重复。


Figure 1 E、F:Western Bot实验验证小鼠血清中DMAb-ZK190和DMAb-ZK190-LALA编码的单克隆抗体
与Zika病毒 E蛋白的结合。

作者利用体外In-Cell Western™ 中和实验测定DMAbZK190和DMAb-ZK190-LALA体外中和活性,发现体内由DMAb产生的ZK190单克隆抗体很有效,保持了中和寨卡病毒感染的功效。结果(a)(b)(c)分别为评估注射了DMAbZK190、DMAb-ZK190-LALA或阴性对照小鼠第7天梯度稀释血清中ZK190单克隆抗体阻断寨卡病毒PR209感染Vero细胞的能力。非线性回归分析确定中和感染血清中的DMAb浓度,实验组与对照组(仅接受病毒未注射DMAbZK190、DMAb-ZK190-LALA)相比,中和率(阻断病毒感染细胞能力)达50%,“ n”是指生物学重复。


Figure 4:体外In-Cell Western™ 中和实验体测定DMAbZK190和DMAb-ZK190-LALA体外中和活性

不仅如此,利用In-Cell Western技术,不仅可以进行中和实验分析,还可以实现对细胞样本中病毒滴度的检测和对抗病毒药物的高效筛选。

In-Cell Western结合了Western blot 技术的特异性与 ELISA 技术的可复制性和通量,目前已成为研究病毒感染特性的高效、快速、可靠的实验技术。

In-cell western 技术原理与实验流程

In-cell western 技术可监测细胞感染的HSV-1病毒

如上图所示,在96孔细胞培养板中用不同滴度的 HSV-1 病毒感染 Vero 细胞,完成细胞固定和一抗孵育后,使用LI-COR 近红外荧光二抗孵育,最后用 Odyssey 近红外成像系统检测荧光信号。不仅可以通过荧光信号强度判断细胞所感染的病毒滴度,而且可以根据荧光信号的位置锁定病毒感染部位。标准菌斑分析法(SPA)佐证了 In-cell western 实验结果的准确性。

In-cell western 技术优势

▪ 省时,直接在微孔板检测,无需细胞裂解、跑胶和转膜等过程

▪ 高通量,一次可实现96/384个样品检测

▪ 数据变异小,直接对细胞内的蛋白进行检测,特异性好,灵敏度高

▪ 双通道同时检测,不同荧光标记二抗同时检测两个蛋白

参考文献:

Rianne N. et al.In Vivo Delivery of a DNA-Encoded Monoclonal Antibody Protects Non-Human primates against Zika Virus. Molecular Therapy Vol. 27 No 5 May 2019.
Weldon, S.K., et. al. (2010). Journal of Virological Methods, 168(1–2), 57–62. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.04.016

LI-COR Biosciences公司在近红外荧光成像领域已有25年的积淀。25年来,LI-COR Odyssey®双色红外激光成像系统由于可实现Western Blot精确定量,多重Western Blot检测,且重复性更高,通量更高,拥丰富的应用范围,因而得到了全球生物医学研究人员的信赖。

丰富的应用

基因有限公司作为LICOR产品中国区代理商,为您提供专业的近红外成像技术在Western Blot、In-Cell Western、双色EMSA、活体成像等方面的解决方案,提供更多应用咨询及技术支持。进一步了解更多详细内容,请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司工作人员。

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