高质量的空间转录组学数据长什么样?

【字体: 时间:2023年01月16日 来源:基因有限公司

编辑推荐:

  空间转录组学研究在加速,科学家们也在试图找到一种评估标准来帮助他们确保使用的工具和技术能够产生尽可能可靠、可用的数据。科学家们需要知道要注意哪些指标,以及可以期望的高质量数据是什么样的。

空间转录组学研究技术层出不穷,包括基于激光显微切割技术的Geo-Seq、探针捕获mRNA结合转录组测序、以及原位探针杂交加多轮超分辨荧光显微成像技术(比如MERFISH)等。后者可以实现单细胞分辨率的空间转录组研究,更好地分析细胞类型组成、细胞之间的空间临近、细胞通讯等。空间转录组学研究在加速,科学家们也在试图找到一种评估标准来帮助他们确保使用的工具和技术能够产生尽可能可靠、可用的数据。科学家们需要知道要注意哪些指标,以及可以期望的高质量数据是什么样的。我们描述了四个关键问题,您可以在比较空间转录组学技术时用来评估数据质量。

灵敏度

与表达的转录本总数相比,一项技术能检测到的转录本的相对数量,也称为检测效率。

每个细胞中每种表达RN的拷贝数都是有限的,通常情况下,即使是功能相关的基因也可以在相对较低的转录拷贝数下表达。在过去的十年中,科学家们一直在单细胞水平上研究转录组学,没有空间背景,使用单细胞测序技术来了解细胞类型和状态。与单细胞RNA测序相当或更好的灵敏度能提供对样本细胞组成的详细了解。可以通过比较不同技术对共同基因的每个细胞检测到的转录本数量来表征灵敏度。与单细胞测序相比,MERSCOPE具有更高的灵敏度。

灵敏度为何重要?

空间生物学能够绘制组织中细胞的组成,这依赖于技术能够检测足够数量的转录本的能力,以精细地描述细胞类型和状态的变化。如果灵敏度有限,这项工作不可能实现。许多功能相关的基因在每个细胞中表达不到10个转录本拷贝,因此低灵敏度的空间工具可能无法检测到这些基因,因此发现不了重要的生物学。更好的转录本检测提高了跨应用领域的生物学相关性和检测细胞间更细微变化的能力。

特异性

在生物样本中与真实转录本相对应的报告转录本的比例。

对于具有单分子分辨率的空间转录组学技术,错误识别的转录本会产生噪音,从而掩盖真实的生物学。

许多因素会影响空间转录组学的准确性,包括组织中游离的自体荧光、不完全的探针结合或分子拥挤。MERFISH使用抗错条形码方案来减少转录本检测误差,允许在生物组织荧光成像固有的噪声出现时进行计算误差校正。一些空间转录组学技术存在非特异性RNA探针结合的风险,但这也是可以克服的。MERFISH技术利用基质嵌入和组织透明化来减少异常RNA信号。

特异性可以通过将空间转录组学技术的数据与成熟的前身技术(如Bulk RNA测序或scRNA-seq)进行比较来表征。与scRNA-seq比较有助于将样本中每种细胞类型的细胞数量变化与检测到的基因表达谱进行比较分析。MERSCOPE能够与单细胞RNA测序保持很强的相关性,即使是表达最低的转录本。

为何特异性很重要?

空间转录组数据必须准确地验证已建立的生物学,为发现新的生物学提供坚实的基础。不准确的数据可能导致不准确的结果和结论,因为转录本可能在基因没有真正表达的细胞或组织部分中被检测到。

当在单细胞水平上描述基因表达时,根据MERSCOPE数据,关键髓系细胞类型标志物CSF1R和CD14的表达在髓系细胞群中高度富集,如下图所示的UMAP表示。然而,在其它空间转录组技术数据中,这些关键髓细胞标记物的富集是微弱的或不存在的。MERSCOPE高精度地再现了已知生物学,为扩展我们对生物学的理解提供了基础。

信息密度

在给定的组织体积或区域内可以检测到的信息量。

细胞的体积是有限的,每个细胞内所能检测到的信息量直接影响着我们对生物学了解的多少。单分子空间转录组学方法是基于显微镜的,因此,每个组织体积所能检测的信息量与光学系统的质量直接相关。MERSCOPE光学系统针对单分子检测进行了优化。使用高数值孔径物镜,从每个单独的转录本中检测到更多的荧光,并且转录本在相机上看起来更小。在给定的组织体积内可以检测到更多的转录本,每个细胞可以检测到更多的信息。

为何信息密度很重要?

每个空间转录组学平台都有一个限制,即每单位体积能准确检测到多少转录本,且具有较高的准确性和特异性。检测每个细胞的更多信息可以更精确地比较细胞之间的转录差异,并识别生物组织中细胞类型和状态的更细微变化。超过信息密度的限制可能会影响准确性和灵敏度,导致数据在生物学上一致性差。

有效的多重能力

空间转录组学技术在一次实验中可以检测到的RNA数量。

需要注意的是,真正的多重检测能力有时不受目标基因数量的限制,而是受噪声底限,或环境背景信号的限制。在以噪声为主的水平上表达的基因无法有效检测。对于高度特异性和灵敏度的检测,有效多重能力可以匹配目标多重能力,所有目标基因均能被有效的检出。由于特异性和灵敏度较低,目标多重能力和有效多重能力之间可能存在较大差距,尽管想要检测的基因数量更多,但实际只有少数基因被准确检测到。因此,有效的多重能力可以理解为在噪声底限之上精确检测的基因数量与想要检测的基因数量的比较。

为何有效的多重能力重要?

如果只有一小部分基因可以被可靠地检测和识别,那么基因panel中基因数量再多也没用。组织中不同类型的细胞表达不同RNA。为了获得完整和精确的空间背景,研究人员需要在同一样本中准确检测数百种RNA。

空间转录组学的研究方法已经出现了爆炸式增长,但许多方法难以建立,不一致,并且需要大量的故障排除。商业平台正在慢慢出现,截至2022年秋,Vizgen已经发布了大量的数据集。

MERSCOPE:如何符合高质量空间转录组数据标准?

综上所述,高质量的空间转录组学数据需要具备高的灵敏度、特异性、信息密度以及有效的多重检测能力。MERSCOPE提供高质量的空间转录组学数据,同时提供可扩展的功能范围:

▪ 自定义gene panel设计—选择与您的生物学问题最相关的基因
▪ 细胞边界染色—精确的细胞分割和单细胞分析
▪ 多组学—检测同一样品中的RNA和蛋白质

有了高质量的数据,您可以在每个层面上揭示生物学的复杂性,从亚细胞表达到肿瘤、器官和重要组织中的细胞类型分化。满怀信心地报告结果,以推进您的领域并产生持久的影响。

参考文献:

1. Method of the year 2020: Spatially resolved transcriptomics. Nature Methods 18, (2021).
2. Zhang, M., Eichhorn, S.W., Zingg, B., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by merfish. Nature 598, 137–143 (2021).
3. Moffitt, J. R. & Zhuang, X. RNA imaging with multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology 572, 1–49 (2016).
4. Moffitt, J. R., Hao, J., Bambah-Mukku, D., et al. High-performance multiplexed fluorescence in situ hybridization in culture and tissue with matrix imprinting and clearing. PNAS 113, 14456–14461 (2016).

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 仪器云展台 | 实验云展厅 | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 免费试用 | 有奖调研

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号