还没开始就错了?RT-qPCR样品质控别大意

【字体: 时间:2023年01月18日 来源:基因有限公司

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  NanoDrop™ One/OneC内置的Acclaro™智能污染物鉴定技术可准确测定出RNA样品中的蛋白质和残留的提取试剂(包括苯酚)等污染物4,并自动校准给出真实核酸样本浓度,保证科研工作者得到准确的RT-qPCR实验结果。

RT-qPCR是分子生物学一项常规的实验技术,用于基因表达定量等各种应用。MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南中规定了RT-qPCR实验数据发表所必需的最少实验信息:包括RNA浓度、纯度、污染物等1。常见核酸提取试剂盒中的苯酚等污染物质会导致核酸浓度偏高,蛋白质和苯酚污染会抑制DNA聚合酶活性,苯酚会使逆转录酶变性等2,3。虽然纯度比是一种可接受的确定纯度的方法,但该比值不能确切的判断污染物的类型,尤其是苯酚等与核酸在同一光谱区域吸收,更加干扰了A260/A280比值。NanoDrop™ One/OneC内置的Acclaro™智能污染物鉴定技术可准确测定出RNA样品中的蛋白质和残留的提取试剂(包括苯酚)等污染物4,并自动校准给出真实核酸样本浓度,保证科研工作者得到准确的RT-qPCR实验结果。

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NanoDrop One/OneC的污染物鉴定及校正功能

在RNA样品中分别加入苯酚、TRIzol、BSA和血红蛋白后,使用NanoDrop One/OneC分光光度计上的RNA应用对样品进行测量。NanoDrop One/OneC的Acclaro™技术能够准确识别污染物类型,并给出校正后的浓度。

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NanoDrop One/OneC污染物分析功能降低污染物对Cq值的影响

对于有机溶剂(苯酚、TRIzol)污染,对照组Cq为24,掺了苯酚的样品组Cq为28.5,校正浓度后Cq为26.6。掺了TRIzol的样品组Cq为25.3,校正浓度后为23.8。当RNA样品中有苯酚、TRIzol等有机溶剂污染时,这些有机溶剂会使逆转录酶和聚合酶变性,提高Cq值导致假阴性结果。使用NanoDropOne/OneC可以在质控时提示污染物类型,并使用真实的样品浓度对下游RT-qPCR实验结果进行有效修正。 

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对于蛋白质污染,对照组的Cq为24。掺了BSA的样品组Cq为31.4,校正浓度后为27.4。掺了血红蛋白的样品组Cq为28.8,校正浓度后为27.9。当RNA样品中有蛋白质的存在会抑制聚合酶活性从而降低检测灵敏度或者产生假阴性结果。如果蛋白污染物消光系数较小(如BSA等),NanoDropOne/OneC可以在质控时提示污染物类型,并可以通过使用真实的样品浓度对实验结果进行有效修正。但是污染物消光系数过高(如Hemoglobin等蛋白质污染)将不能触发Acclaro校正功能,无法对下游实验进行有效修正。

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NanoDrop One/OneC在RT-qPCR实验样本质控中的优势

1、NanoDrop One/OneC检测仅需1-2ul样品,且无需稀释,仅在8秒内便可获得A260/A280和A260/A230纯度比值以及样品浓度,为RT-qPCR反应提供可靠的质控。

2、内置的Acclaro智能样本检测技术能够有效识别dsDNA和RNA中的污染物类型,并且给出校正后的真实样品浓度,使得RT-qPCR实验结果更有保障。

如何去除各种污染物

1、如果NanoDrop One/OneC鉴定出RNA样品中有苯酚、蛋白质污染,可以在RNA提取时重复苯酚-氯仿抽提过程并在分离时进行细致的移液操作;

2、如果鉴定出RNA样品中有胍盐污染,可以重新用异丙醇或乙醇沉淀RNA以达到去盐的效果;

3、而当RNA样品中有DNA污染时,实验者可以采用DNase、氯化锂沉淀、重新进行苯酚-氯仿抽提等多种方法来去除DNA污染。

引用文献:

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, NolanT, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). The MIQE guidelines:minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. ClinChem. 55 (4): 611-22.

2. Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). DNA, RNA, and protein extraction: the pastand the present. Journal of biomedicine & biotechnology, 2009,574398.https://doi.org/10.1155/2009/574398.

3. Toni, L. S., Garcia, A. M., Jeffrey, D. A., Jiang, X., Stauffer, B. L., Miyamoto, S.D., & Sucharov, C. C. (2018). Optimization of phenol-chloroform RNA extraction.MethodsX, 5, 599–608. https://doi.org/10.1016/j.mex.2018.05.011.

4. Bélec, L., Authier, J., Eliezer-Vanerot, M. C., Piédouillet, C., Mohamed, A. S.,& Gherardi, R. K. (1998). Myoglobin as a polymerase chain reaction (PCR)inhibitor: a limitation for PCR from skeletal muscle tissue avoided by the useof Thermus thermophilus polymerase. Muscle & nerve, 21(8), 1064–1067.https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4598(199808)21:8<1064::aid-mus11>3.0.co;2-u.

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基因有限公司作为Thermo的忠实合作伙伴,在国内推广NanoDrop产品线近20年,在全国19个大中城市设有办事处或者联络点,接下来也将会一如既往地继续为广大客户提供包括NanoDrop在内的产品售前咨询、售后支持和仪器维护维修等优质服务。 

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