NanoDrop在核磁共振、X射线晶体学和低温电镜工作流程中的应用

【字体: 时间:2023年01月31日 来源:基因有限公司

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  NanoDrop One/OneC微量紫外/可见分光光度计仅需1-2ul样品就可以在8秒内得出真实的蛋白浓度,同时内置的Acclaro智能污染物分析功能可以有效识别蛋白样品中的污染物,并报告校正后的蛋白浓度。

由于蛋白质功能与结构相关,通过结构生物学方法确定蛋白质结构可以更好地理解分子机制。因此近年来,核磁共振(NMR)、X射线晶体学(XRC)和低温电子显微镜(Cryo-EM)等结构生物学方法已成为药物发现、病毒研究和许多其他应用的主要方法1。NMR、XRC和Cryo-EM检测流程要求蛋白样品保持足够纯度和浓度以产生有价值的数据。NanoDrop One/OneC微量紫外/可见分光光度计仅需1-2ul样品就可以在8秒内得出真实的蛋白浓度,同时内置的Acclaro智能污染物分析功能可以有效识别蛋白样品中的污染物,并报告校正后的蛋白浓度。NanoDrop One/OneC让用户可以实时验证样品在各个步骤中的纯度与浓度,是结构生物学工作流程中十分高效的工具。

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图1 Acclaro智能污染物鉴定技术。有效识别蛋白质中的DNA污染物,修正后的光谱显示为黄色,
原始光谱显示为绿色,污染光谱显示为橙色。

NanoDrop 在核磁共振工作流程中的应用

NMR的功能基于原子与磁场的相互作用。对于某些原子核,它们会表现出产生磁场的自旋,这取决于原子核是否具有未配对的质子或中子。当向原子施加外部磁场时,原子核将处于低能态或高能态,当它行进到相反的能态时,分别吸收或发射能量。这种能量的吸收或发射最终显示为NMR光谱中的峰值,核磁共振分析可以提供目标蛋白的具体结构细节2。NMR工作流程首先通过重组表达产生感兴趣的蛋白质。根据Hoseini和Sauer(2015)概述的方案,通常先用PCR扩增目标序列,然后对PCR产物进行纯化,纯化产物用限制性内切酶消化3,通过凝胶电泳分离DNA,随后从凝胶中提取DNA,分离出DNA后用NanoDrop One/OneC测定纯度和浓度。纯度和浓度合格后,在连接酶作用下连接入载体,再转入大肠杆菌(E. coli)中用于DNA质粒的转化,然后培养细胞来翻译目标蛋白。可以使用NanoDrop One/OneC中OD600功能测定浓度,当细胞培养物达到所需表达量时,裂解细胞以提取目标蛋白,并纯化蛋白用于NMR应用4。最终浓度可以在NanoDrop One/OneC上测量,以确定应用于NMR的准确浓度5。NMR数据收集提供了峰图,通常蛋白质浓度越高,峰在光谱上的表现就越好。根据核磁共振谱,可以确定序列特定的共振分配,最终完成蛋白质结构的计算。

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图2: 核磁共振工作流程

NanoDrop在XRC工作流程中的应用

XRC利用电子对X射线的散射作用,可以获得晶体中电子密度的分布情况,再从中分析获得原子的位置信息。基于几何数学,从特定的衍射图案确定电子密度图。利用电子密度图中的信息,可以识别蛋白质的原子模型,包括二级结构6。如图3所示,目标蛋白质必须通过重组表达产生,并在结晶试验之前进行纯化。为了形成晶体,必须优化结晶溶液,包括缓冲液、沉淀溶液和任何添加剂,以支持晶体的生长,这可以在具有可变溶液条件的96孔板中进行。晶体形成的另一个重要因素是初始蛋白质样品浓度,如果样品太稀,可能不会发生成核;如果样品太浓,可能会形成沉淀而不是结晶固体7,这一过程可以使用NanoDrop One/OneC确保结晶实验的最佳浓度(图3)。

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图3 X射线晶体学工作流程

NanoDrop 在Cryo-EM工作流程中的应用

冷冻电镜是研究蛋白质结构和功能的一种相对较新的方法,由于不需要晶体,引起了许多蛋白质生物学家的兴趣。Cryo-EM利用高剂量电子束穿过样品,散射的电子被透镜系列聚焦。为了保护样品不受电子辐射的破坏作用,需将蛋白质样品玻璃化,使蛋白质复合物保持在天然状态8。Cryo-EM单颗粒分析的工作流程与NMR和XRC相同,首先进行所需蛋白质的重组表达,然后进行提取和纯化(图4)。一旦蛋白质被纯化,样品就会进行阴性染色以评估样品纯度,并进一步优化样品以应用于Cryo-EM网格(Cryo-EM网格可以在使用透射电子显微镜获取图像时支撑样品)8。样品优化需要确定适当的蛋白质浓度,如图4所示,NanoDrop One/OneC可与阴性染色结合使用,以确定蛋白质纯度以及网格制备的浓度,防止样品中的一些污染物干扰蛋白质的3D重建。在优化之后,样品被玻璃化以保存在原始状态。之后对冰质、颗粒分布、均匀性进行筛选,得到最佳网格,以用于数据采集和后续3D重建9

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图4 Cryo-EM工作流程

NanoDrop One/ OneC内置的Acclaro智能污染物鉴定技术可以有效识别蛋白样品中的污染物,并报告校正后的蛋白浓度。帮助研究者在NMR、XRC和Cryo-EM检测前确定蛋白质的浓度与纯度,避免污染物对蛋白质的结构成像产生影响,从而浪费时间和资源。加上NanoDrop One/ OneC一体化的设计、方便准确的检测模式,使它可以成为NMR、XRC和Cryo-E工作流程的有效补充。

引用文献:

1. Yee, A. A., Savchenko, A., Ignachenko, A., Lukin, J., Xu, X., Skarina, T., Evdokimova, E., Liu, C. S., Semesi, A., Guido, V., Edwards, A. M., & Arrowsmith, C. H. (2005). NMR and X-ray crystallography, complementary tools in structural proteomics of small proteins. Journal of the American Chemical Society, 127(47), 16512–16517. https://doi.org/10.1021/ja053565.

2. Hornak, J. P. (1997–1999). The Basics of NMR. Rochester, NY: J.P. Hornak.

3. Hoseini, S. S., & Sauer, M. G. (2015). Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. Journal of biological engineering, 9, 2. https://doi.org/10.1186/1754-1611-9-2

4. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. (2000). Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman. Section 7.1, DNA Cloning with Plasmid Vectors.

5. Structural Genomics Consortium, China Structural Genomics Consortium, Northeast Structural Genomics Consortium, Gräslund, S., Nordlund, P., … Gunsalus, K. C. (2008). Protein production and purification. Nature methods, 5(2), 135–146. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202.

6. Sands, D. E. (1975). Introduction to Crystallography; Dover Publications, Inc.; New York.

7. Jones, P.G. (1981). Chemistry in Britain, 17, 222–225.

8. Milne, J. L., Borgnia, M. J., Bartesaghi, A., Tran, E. E., Earl, L. A., Schauder, D. M., Lengyel, J., Pierson, J., Patwardhan, A., & Subramaniam, S. (2013). Cryo-electron microscopy--a primer for the non-microscopist. The FEBS journal, 280(1), 28–45. https://doi.org/10.1111/febs.12078.

9. Drulyte, I., Johnson, R. M., Hesketh, E. L., Hurdiss, D. L., Scarff, C. A., Porav, S. A., Ranson, N. A., Muench, S. P. & Thompson, R. F. (2018). Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Cryst. D74, 560–571.

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基因有限公司作为Thermo的忠实合作伙伴,在国内推广NanoDrop产品线近20年,在全国19个大中城市设有办事处或者联络点,接下来也将会一如既往地继续为广大客户提供包括NanoDrop在内的产品售前咨询、售后支持和仪器维护维修等优质服务。

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