NanoDrop在核磁共振、X射线晶体学和低温电镜工作流程中的应用

由于蛋白质功能与结构相关，通过结构生物学方法确定蛋白质结构可以更好地理解分子机制。因此近年来，核磁共振(NMR)、X射线晶体学(XRC)和低温电子显微镜(Cryo-EM)等结构生物学方法已成为药物发现、病毒研究和许多其他应用的主要方法¹。NMR、XRC和Cryo-EM检测流程要求蛋白样品保持足够纯度和浓度以产生有价值的数据。NanoDrop One/OneC微量紫外/可见分光光度计仅需1-2ul样品就可以在8秒内得出真实的蛋白浓度，同时内置的Acclaro智能污染物分析功能可以有效识别蛋白样品中的污染物，并报告校正后的蛋白浓度。NanoDrop One/OneC让用户可以实时验证样品在各个步骤中的纯度与浓度，是结构生物学工作流程中十分高效的工具。

图1 Acclaro智能污染物鉴定技术。有效识别蛋白质中的DNA污染物，修正后的光谱显示为黄色，
原始光谱显示为绿色，污染光谱显示为橙色。

NanoDrop 在核磁共振工作流程中的应用

NMR的功能基于原子与磁场的相互作用。对于某些原子核，它们会表现出产生磁场的自旋，这取决于原子核是否具有未配对的质子或中子。当向原子施加外部磁场时，原子核将处于低能态或高能态，当它行进到相反的能态时，分别吸收或发射能量。这种能量的吸收或发射最终显示为NMR光谱中的峰值，核磁共振分析可以提供目标蛋白的具体结构细节²。NMR工作流程首先通过重组表达产生感兴趣的蛋白质。根据Hoseini和Sauer(2015)概述的方案，通常先用PCR扩增目标序列，然后对PCR产物进行纯化，纯化产物用限制性内切酶消化³，通过凝胶电泳分离DNA，随后从凝胶中提取DNA，分离出DNA后用NanoDrop One/OneC测定纯度和浓度。纯度和浓度合格后，在连接酶作用下连接入载体，再转入大肠杆菌(E. coli)中用于DNA质粒的转化，然后培养细胞来翻译目标蛋白。可以使用NanoDrop One/OneC中OD600功能测定浓度，当细胞培养物达到所需表达量时，裂解细胞以提取目标蛋白，并纯化蛋白用于NMR应用⁴。最终浓度可以在NanoDrop One/OneC上测量，以确定应用于NMR的准确浓度⁵。NMR数据收集提供了峰图，通常蛋白质浓度越高，峰在光谱上的表现就越好。根据核磁共振谱，可以确定序列特定的共振分配，最终完成蛋白质结构的计算。

 

图2: 核磁共振工作流程

NanoDrop在XRC工作流程中的应用

XRC利用电子对X射线的散射作用，可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息。基于几何数学，从特定的衍射图案确定电子密度图。利用电子密度图中的信息，可以识别蛋白质的原子模型，包括二级结构⁶。如图3所示，目标蛋白质必须通过重组表达产生，并在结晶试验之前进行纯化。为了形成晶体，必须优化结晶溶液，包括缓冲液、沉淀溶液和任何添加剂，以支持晶体的生长，这可以在具有可变溶液条件的96孔板中进行。晶体形成的另一个重要因素是初始蛋白质样品浓度，如果样品太稀，可能不会发生成核；如果样品太浓，可能会形成沉淀而不是结晶固体⁷，这一过程可以使用NanoDrop One/OneC确保结晶实验的最佳浓度（图3）。

 

图3 X射线晶体学工作流程

NanoDrop 在Cryo-EM工作流程中的应用

冷冻电镜是研究蛋白质结构和功能的一种相对较新的方法，由于不需要晶体，引起了许多蛋白质生物学家的兴趣。Cryo-EM利用高剂量电子束穿过样品，散射的电子被透镜系列聚焦。为了保护样品不受电子辐射的破坏作用，需将蛋白质样品玻璃化，使蛋白质复合物保持在天然状态⁸。Cryo-EM单颗粒分析的工作流程与NMR和XRC相同，首先进行所需蛋白质的重组表达，然后进行提取和纯化(图4)。一旦蛋白质被纯化，样品就会进行阴性染色以评估样品纯度，并进一步优化样品以应用于Cryo-EM网格(Cryo-EM网格可以在使用透射电子显微镜获取图像时支撑样品)⁸。样品优化需要确定适当的蛋白质浓度，如图4所示，NanoDrop One/OneC可与阴性染色结合使用，以确定蛋白质纯度以及网格制备的浓度，防止样品中的一些污染物干扰蛋白质的3D重建。在优化之后，样品被玻璃化以保存在原始状态。之后对冰质、颗粒分布、均匀性进行筛选，得到最佳网格，以用于数据采集和后续3D重建⁹。

 

图4 Cryo-EM工作流程

NanoDrop One/ OneC内置的Acclaro智能污染物鉴定技术可以有效识别蛋白样品中的污染物，并报告校正后的蛋白浓度。帮助研究者在NMR、XRC和Cryo-EM检测前确定蛋白质的浓度与纯度，避免污染物对蛋白质的结构成像产生影响，从而浪费时间和资源。加上NanoDrop One/ OneC一体化的设计、方便准确的检测模式，使它可以成为NMR、XRC和Cryo-E工作流程的有效补充。

引用文献：

1. Yee, A. A., Savchenko, A., Ignachenko, A., Lukin, J., Xu, X., Skarina, T., Evdokimova, E., Liu, C. S., Semesi, A., Guido, V., Edwards, A. M., & Arrowsmith, C. H. (2005). NMR and X-ray crystallography, complementary tools in structural proteomics of small proteins. Journal of the American Chemical Society, 127(47), 16512–16517. https://doi.org/10.1021/ja053565.

2. Hornak, J. P. (1997–1999). The Basics of NMR. Rochester, NY: J.P. Hornak.

3. Hoseini, S. S., & Sauer, M. G. (2015). Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. Journal of biological engineering, 9, 2. https://doi.org/10.1186/1754-1611-9-2

4. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. (2000). Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman. Section 7.1, DNA Cloning with Plasmid Vectors.

5. Structural Genomics Consortium, China Structural Genomics Consortium, Northeast Structural Genomics Consortium, Gräslund, S., Nordlund, P., … Gunsalus, K. C. (2008). Protein production and purification. Nature methods, 5(2), 135–146. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202.

6. Sands, D. E. (1975). Introduction to Crystallography; Dover Publications, Inc.; New York.

7. Jones, P.G. (1981). Chemistry in Britain, 17, 222–225.

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9. Drulyte, I., Johnson, R. M., Hesketh, E. L., Hurdiss, D. L., Scarff, C. A., Porav, S. A., Ranson, N. A., Muench, S. P. & Thompson, R. F. (2018). Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Cryst. D74, 560–571.

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