Iso-Seq 发现新剪接异构体，揭露鲑鱼虱的转录秘密！

在这篇文章中，Sine等人通过PacBio的Iso-Seq技术构建了成年雌性鲑鱼虱和其幼虫的转录组，并强调了PacBio Iso-Seq的应用和价值。

随着现代生命科学领域的不断发展，转录组学研究的重要性逐渐凸显。传统的转录组测序是利用第二代高通量测序（NGS）技术对某一物种特定器官或组织在某一特定状态下，所有RNA进行反转录形成的cDNA进行测序，从而全面迅速了解特定状态下几乎所有的转录本信息。然而，基因在表达的过程中，转录而来的mRNA经过可变剪接，可产生多个剪接异构体，这大大增加了基因组的蛋白编码多样性。传统的二代测序技术由于其短读长的特点，难以准确表征剪接异构体的多样性。

全长转录组测序（Isoform-Sequencing，Iso-Seq）是PacBio公司开发的基于HiFi测序技术的全长转录本高通量测序技术。该技术无需打断RNA，直接对（包含5’UTR直到3’polyA尾序列信息的）全长的cDNA序列进行测序，相比于打断后再组装的NGS技术，能够更加精确地表征整个转录组的全长剪接异构体信息。同时，还能够通过转录本上所检测到的单碱基多态性（SNP）来对等位基因的不平衡表达进行分析。Iso-Seq这一系列的优势，更进一步改善了基因的注释和发掘，必将给基因组学，转录组学的研究领域，带来更多新的发现。

在De novo high-accuracy transcriptomes from long-read sequencing reveals a wide variety of novel splice variants in copepodids and adult female salmon lice (Lepeophtheirus salmonis)这篇文章中，Sine等人通过PacBio的Iso-Seq技术构建了成年雌性鲑鱼虱和其幼虫的转录组，并强调了PacBio Iso-Seq的应用和价值。虱类寄生虫，特别是成年雌性鲑鱼虱及其幼虫，对鱼类养殖业构成了严重的威胁。了解其生物学特性，尤其是基因表达和调控机制，对于开发防控措施至关重要。Iso-Seq是揭示基因剪接变体和全长转录本的强大工具，对于了解虫类寄生虫的转录组具有重要价值。

在该文中，研究人员首先对幼虫和成虫阶段的雌性鲑鱼虱（雄性鲑鱼虱研究较为困难）是否存在转录组水平的差异进行了探索。作者使用PacBio的Iso-Seq技术，生成了一份包含31,092个经过纠错的高质量全长转录本的非冗余的全新转录组数据。然后，研究人员运用了SQANTI3分类方法进行分类。他们发现超过50%的转录本是新的剪接异构体。这些新的剪接异构体包含已知剪切元件的新转录本（NIC，novel in catalog，24%）和未知剪切元件的新转录本（NNC, novel not in catalog，29%）。在这两个类别中，独特存在于幼虫或成年雌性鲑鱼虱中的转录本占主导地位，NIC中有45%的转录本仅存在于幼虫中。此外，还有8%的转录本属于ISM（Incomplete splice match），它们在参考基因组上部分匹配，但在5'端、3'端或两者都有差异。

图1. 每个分类的结构类别(SQANTI3)中的mRNA转录本的数量。根据左侧Y轴给出仅出现在幼虫（深蓝色条）、仅出现在成年雌性鲑鱼虱（浅蓝色条）或两个样本（组合色条）中的比例 。SQANTI 结构类别——已知转录本 (FSM)：与基因组中预测的转录本相同匹配（≥ 95% 序列同一性）；不完全剪接匹配（ISM）：部分匹配参考，但在 5' 端、3' 端或两者均不同；包含已知剪切元件的新转录本（NIC）：具有已知剪接位点的新组合的新颖亚型；包含未知剪切元件的新转录本（NNC）：具有至少一个新剪接位点的新型亚型；Intergenic：位于注释基因边界之外的新基因的转录本；Genic：先前预测为内含子或位于内含子/外显子或基因间/外显子边界的新基因的转录本；Fusion：跨越两个或多个带注释的基因座的转录本；Antisense：将反义转录为预测参考。

紧接着研究人员对新发现的剪接异构体与虱类寄生虫的生命周期和寄主适应性相关的问题进行了探索。研究人员使用Gene Ontology(GO)和预测的氨基酸序列的blastp分析，成功地为88%全长转录本提供了GO术语和/或替代的功能描述。通过对幼虫和成年雌性鲑鱼虱的转录组进行比较发现，有三分之一的转录基因在幼虫或成年雌性鲑鱼虱样本中是唯一表达的。在成年雌性鲑鱼虱中唯一表达的高表达转录本主要与卵子发育和繁殖有关。而在幼虫中唯一表达的高表达转录本则包括与外骨骼形成、生长和发育有关的角质蛋白和胶原链。虽然成年雌性鲑鱼虱的raw reads比幼虫样本多，但最终的转录组数据中来自幼虫样本的转录本数量比来自成年雌性鲑鱼虱的转录本数量更多（幼虫独有的转录本+二者共有的转录本>成年雌性鲑鱼虱转录本+二者共有转录本）。这种现象反映了与寄生阶段相比，作为早期生命阶段的自由生活和寻找宿主的幼虫，对灵活性的需求更大。因此，通过这些独特表达的转录本，可以更好地理解幼虫和成年雌性鲑鱼虱之间的生物学差异。同时，研究人员还发现了这些可变剪接在幼虫和成年雌性鲑鱼虱中表现出不同的表达水平。这些研究结果，有助于揭示虱类寄生虫在不同环境下的基因表达变化，促进进一步理解其寄主适应性，将为鱼类养殖过程中寄生虫的控制提供一定价值。

图2. 每种注释类型的转录本百分比。Any annotation：至少收到下述功能注释之一的转录本；OmicsBox 基因：从 OmicsBox 接收基因名称的转录本，该基因名称基于 RefSeq 中前 20 个blast hits中最常见的基因名称；Enzyme name：从 OmicsBox 注释为预测酶的转录本；GO ID：从 OmicsBox 功能注释中接收到一个或多个 GO ID 的转录本；Description：接收 OmicsBox 基于对前 20 个blast hits中描述的自然语言处理生成的基因描述的转录本。

综上所述，这项研究突出了PacBio长读长测序技术在Iso-seq研究中的应用价值。通过PacBio的帮助，不仅更深入地了解了虱类寄生虫的剪接异构体和转录组，还揭示了其生命周期和寄主适应性的调控机制。Iso-Seq的应用不仅对虱类寄生虫研究具有重要意义，同时对生命科学其他领域的研究也具有广泛的应用价值。

以PacBio HiFi测序为代表的三代测序技术，突破了二代测序GC偏好性及短读长的限制，HiFi reads（High Fidelity  reads）基于环形一致性测序（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式，产生出既有较长的读长（最长可达25kb的长度），又具有较高的序列精度（约99.9%准确率）的测序结果。

基因有限公司作为PacBio公司在中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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