10x 实验技巧分享 | 单细胞样本制备的常见问题

单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及基于单细胞或单细胞核的其他测序方法（比如免疫分析或染色质可及性分析）都是功能强大的方法，让研究人员能够逐个细胞地探索基因表达动态、基因调控、抗原特异性等。然而，为了充分利用这些工具，您首先要知道如何正确制备样本。

事实上，单细胞实验的上游工作与实验本身同样重要。熟练的样本制备将是实验成功的关键决定因素，它能够产生高质量的单细胞或单细胞核悬液。

因此，我们希望尽我们所能，确保您掌握单细胞样本制备所需的技巧和诀窍。这包括一些基本知识——细胞还是细胞核、起始细胞数、如何最大限度提高细胞活力、样本运输管理——以及更多方面的考量。

在这篇文章中，我们将重点回答一些有关单细胞样本制备的常见入门问题，您可以获得一些有用的技巧以及细胞制备指南和产品文档，它们将帮助您自信地开展单细胞或单细胞核样本的制备。

若您有兴趣深入了解新鲜、冷冻或固定样本（甚至是FFPE）的单细胞RNA-seq？敬请关注后续文章，它将对Chromium单细胞基因表达Flex的样本制备进行全面介绍。

01 实验设计决定了样本制备的选择

✔ 我的实验应该使用单个细胞还是细胞核？

您的整体实验设计，特别是您准备测定的分析物，将决定您应使用单个细胞还是细胞核。scRNA-seq对细胞和细胞核都适用，在大多数情况下，您会得到非常相似的结果。不过，如果您打算测定B细胞受体或T细胞受体（BCR/TCR）序列或其他细胞表面蛋白，您就需要在实验中保留完整的细胞。如果您准备测定染色质可及性，则需要使用细胞核。

此外，您正在处理的组织或体液可能也会影响细胞或细胞核的选择。例如，在某些情况下，肝细胞和神经元体积过大，无法通过Chromium仪器的微流控通道，该通道可容纳直径达30 μm的细胞。在这种情况下，您需要从样本中分离出细胞核。有些细胞的形状很有挑战性（比如心肌细胞或酵母细胞），因此分离细胞核更合适。还有些复杂组织很难解离成单细胞悬液，因此对它们来说，细胞核分离可能是更好的选择。

✔ 单细胞实验需要多少个细胞？

这个问题不能简单地用一个数字来回答，它取决于样本的复杂程度和您提出的实验问题。样本越复杂，您需要的细胞就越多——复杂的意思是样本异质性高，或样本中含有脆弱细胞，在样本制备过程中通常更难维持细胞状态。此外，如果您有兴趣分析稀有细胞群，那么可能需要从更多的细胞入手，以确保您能识别那些比例较低的细胞类型。

另一方面，如果您的样本相当均质且稳定，而且大多数细胞在整个实验过程中（包括各种处理和样本制备步骤）的反应相似，那么起始细胞数可以少一些。

重要的是记住，我们的单细胞分析有着高达65%的细胞捕获率，这意味着您将看到65%的细胞被回收并上样到芯片上。您在计划合适的细胞数时应当考虑到这一捕获率，这样才能达到最终的目标细胞数。在设计实验时还应考虑测序要求，因为使用的细胞越多，则测序成本越高。

02 如何确保获得最高质量的单细胞样本

✔ 为什么样本质量很重要？

您需要确定您正在从单个细胞中捕获信息。如果细胞不完整，就会造成RNA渗漏，增加背景信号。因此，质量不佳的样本最终会降低我们对RNA转录本来自特定细胞的信心，以及我们正在捕获该细胞真实信息的信心。

图中显示了一个完整的细胞和一个膜受损的细胞。

✔ 怎样才算高质量的单细胞样本？

在样本制备过程中，您需要记住三个基本的标准。高质量的样本应当满足以下条件：

1.干净：单细胞悬液必须不含碎片、细胞团块及其他任何杂质（如背景RNA、DNA或EDTA）。这需要通过离心步骤洗涤样本，过滤样本以去除碎片或较大颗粒，并通过细胞分选或死细胞去除试剂盒来富集细胞。

2.健康：细胞是活的！我们建议细胞存活率至少达到90%，以确保获得不错的单细胞数据。在准备上样芯片时，细胞应保存在PBS + 0.04% BSA缓冲液中，并置于冰上。这种缓冲液不一定富含营养物质，因此若您认为您的样本需要营养物质，可以使用我们验证过的其他培养基（列在下面的细胞制备指南中），以保持细胞活力。

3.完整：保持细胞膜完整至关重要，这就需要您在处理细胞时动作特别轻柔。我们建议使用宽口径的移液器吸头，缓慢而轻柔地重悬细胞。

欢迎通过以下链接，下载内容详尽的细胞制备指南，了解单细胞样本制备的更多最佳做法。

https://www.10xgenomics.com/cn/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/single-cell-protocols-cell-preparation-guide

✔ 如果我的样本未达到质量标准会怎么样？

也许您仍然可以使用该样本，但重要的是在开展实验之前考虑如何进行样本优化。换句话说，如果您发现解冻或采集的样本未达到质量标准，您应当制定一个改进计划。在这种情况下有很多方法可供选择，包括使用死细胞去除试剂盒、富集活细胞，以及富集或去除特定细胞类型等。

✔ 在上样到Chromium芯片之前，为什么细胞计数很重要？

准确的细胞计数不仅对达到实验设置的目标细胞回收率至关重要，同时也是对样本质量的最后检查。无论是使用手动的血细胞计数器还是使用全自动细胞计数器，关键是过程一致，并包含区分活细胞/死细胞的标志物。当样本中没有太多碎片时，可以使用台盼蓝染色来区分活细胞和死细胞；否则，最好使用荧光染料，以确保不会对细胞碎片进行染色并将它们误判为细胞，特别是在使用全自动计数器时。

✔ 对于细胞核的样本质量，有哪些考虑因素？

细胞核分离需要优化在裂解缓冲液中的孵育时间。裂解应尽可能彻底，在理想的情况下，裂解后悬液中残留的活细胞应少于5%。（当然，这一建议与单细胞解离的目标相反，在解离单细胞时，我们要尽可能多地保留活细胞！）尽管单细胞核样本分离基本会破坏整个细胞，但裂解最好还是从高质量的样本开始，也就是健康的活细胞。

此外，您还要确保分离出的细胞核呈圆形，核膜完整。如果裂解时间过长，细胞核会出现“小泡”，这意味着它表面开始起泡，形状不规则，并可能与其他细胞核形成团块。

图中显示了从高质量细胞核到起泡的低质量细胞核的变化过程。

在处理细胞核时，细胞计数也有所不同。所有的细胞核都会被染色成死细胞。与整个细胞相比，它们也非常小，而且会与其他碎片一起呈悬浮状态。因此，只用台盼蓝计数可能会不准确。考虑到这些情况，我们建议您使用荧光染料（如EthD-1）进行准确计数。

获得高质量的单细胞核悬液可能颇有难度，需要对裂解进行优化。我们的细胞核分离试剂盒已在大量人类和小鼠样本上得到验证，因此能消除这一过程中的不稳定。点击阅读原文，即可了解它如何让单细胞核样本制备变得简单且可重复。

细胞核分离试剂盒的工作流程示意图。

03 样本的储存及运输管理对单细胞制备很关键

样本采集、保存和处理的管理对样本质量和最终数据有巨大的影响。理想的场景是在采集样本后立即进行处理，但实际情况往往并非如此。因此，制定样本保存计划对实验成功至关重要。

✔ 保存细胞培养物和细胞悬液的最佳做法是什么？

通常，细胞培养物很喜欢用其本身的培养基冷冻，并添加DMSO作为冷冻保护剂。之后将其缓慢冷冻至–80℃，并转移到液氮中进行长期保存。

✔ 如何保存新鲜组织用于单细胞样本制备？

如果新鲜组织在解剖或活检后不久就能就近处理，最佳做法是将组织放在冰上短暂保存，然后解离成单细胞悬液。之后，将解离的细胞冷冻在含有DMSO的细胞培养基或专门的细胞冻存液中，保持细胞活力，直到您准备好进行单细胞分析。

若您无法立即将新鲜组织解离成单细胞，那么在选择样本保存方法之前还需要考虑其他一些因素。其中两个因素是您必须等待多长时间才能解离组织，以及您想处理细胞核还是细胞。如果从样本采集到解离的时间间隔少于72小时，那么将样本保存在4℃的组织保存液中是一种可行的方案。这样您也可以处理细胞，但建议进行试点研究，以确保您能通过这种短期保存方法获得活细胞。

如果时间间隔超过72小时，可以考虑在–196℃下速冻整个组织。不过，采用这种处理方法后，后续的样本制备步骤只能进行细胞核分离。或者，如果必须等待72小时以上，您也可以考虑将组织置于冻存液中，放在–80℃，目的是保持整个细胞完整，并保留细胞表面蛋白。在这两种情况下，我们都建议进行试点研究，因为这些保存方法未经过内部验证，有必要测试它们是否与感兴趣的组织兼容。（有关样本保存和运输管理的更多详情，请访问我们的支持页面。）

还有一些其他的样本保存方法，包括固定，我们将不在这篇文章中介绍。敬请期待单细胞样本制备系列的下一部分，我们将概括介绍使用Chromium单细胞基因表达Flex时的样本制备选择。

如果您希望继续了解我们的单细胞产品？这里有几种方法：

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https://www.10xgenomics.com/single-cell-assay-selector/

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