什么？还有人不知道一代测序可以做微生物鉴定？

DS3000您了解多少？

——紧凑型CE一代测序仪 ——

Sanger法测序作为第一代测序技术，价格相对低廉，鉴定所需时间短，准确性高，目前仍然是作为基因检测的金标准而被广泛使用。主要应用于对突变、SNP、插入或者缺失的序列进行验证，对NGS测序结果进行验证以及对细菌、真菌、病毒、寄生虫等进行鉴定分型。

前几次向大家介绍了小身材，大作为！DS3000助力HID检测，如何证明Jurkat是Jurkat？，身材小，用途多！DS3000助力过敏原检测以及身材小，用途多！DS3000助力NGS结果验证（点击查看），相信大家对日立DS3000一代测序仪在片段分析上的应用有所了解。那么今天继续带大家了解DS3000在sanger测序——微生物检测的表现。

检测原理

#DS3000怎么进行微生物检测#

1. DNA检测的优势

 细菌、真菌的鉴定需要以下的要素：

 速度：必须迅速识别病原体，以尽量减少传播；

 敏感性：病原体必须能从感染的早期阶段检测出来；

 精确度：正确处理不能有错误；

 简便性：检查必须在所有地区全面实施。

使用DNA检测方法（DNA testing）在高水平上实现了上述要求。

2. DNA检测流程

一代测序检测是基于16S rDNA。DS3000在16s rDNA扩增的优势就在于简便，系统间容易比较，尺寸最合适(作为阅读碱基长度最合适)，数据库丰富。

图1. 基于一代测序的微生物检测流程

测序结果输出之后可以通过同源性搜索来识别细菌，从测序分析中获得的DNA序列在公共数据库（如NCBI GenBank）中进行搜索，识别最兼容的细菌种类。

图2. 微生物检测结果的比对分析

举个栗子

#DS3000如何进行细菌检测#

以细菌为例，为了解析人类外皮中正常存在的细菌，将手掌放置于琼脂，将沾上微生物后的培养基培养3天，获得了多个菌落。从菌落中提取DNA，进行PCR和循环测序，然后在DS3000上进行测序。

图3. 细菌检测流程

分析得到的测序数据，最后经NCBI Blast搜索比对（选择3个数据库分别进行搜索），均显示收集的菌落属于葡萄球菌属。

图4. 细菌检测结果比对分析

・NCBI 16S ribosomal RNA (Bacteria and Archaea type strains) [ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/16S_ribosomal_RNA.tar.gz];

・Greengens [https://greengenes.secondgenome.com/prefix=downloads/greengenes_database/gg_13_5];

・SILVA SSU release 138.1 [https://www.arbsilva.de/no_cache/download/archive/release_138.1/Exports]

注：仅限科研使用，不可用于医疗诊断及其相关用途。本资料中刊登的数据仅为测试示例，不确保数据的准确性。

#DS3000如何进行真菌检测#

在许多情况下，真菌鉴定与细菌鉴定一样，都涉及核糖体DNA序列的分析。

但与细菌鉴定不同，真菌鉴定是以ITS和26s rDNA区域为目标。以解析橘子表皮发生的霉菌为例做个验证，取橘子表皮上的霉菌，在琼脂培养基（PDA）上分离出真菌菌落，用DS3000先对ITS1区域进行碱基测序，再对D1/D2区进行测序。

图5. 真菌ITS区检测流程

图6. 真菌D1/D2区检测流程

最后将ITS1和D1/D2序列进行Blast，结果显示青霉菌属是最丰富的。因此橙子表皮上的霉菌被推测为青霉属。

图7. 真菌检测结果比对分析

・NCBI Internal transcribed spacer region (ITS) from Fungi type and reference material [ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/ITS_RefSeq_Fungi.tar.gz]

・UNITE　UNITE+INSD fungi datasets Ver8.3[https://doi.org/10.15156/BIO/1281531]

注：仅限科研使用，不可用于医疗诊断及其相关用途。本资料中刊登的数据仅为测试示例，不确保数据的准确性。

结语

更多关于遗传变异分析、病原体分型，MSI，重组质粒验证以及基因编辑验证等领域的应用实例分析且看下回分解。

“小身材，大作为”

DS3000期待您的关注！

HITACHI公司是专业的一代测序仪生产与制造公司，其代表产品DS3000秉承日立多年来研究开发的毛细管技术与激光辐射技术成为性能优异的小型CE测序仪。基因有限公司作为HITACHI公司的特约经销商，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑、应用培训与售后维护工作等。