微量苯酚，无所遁形!——NanoDrop助力核酸质控

NanoDrop One/One^C

图1：NanoDrop One/One^C

在这个后基因组时代，核酸的定量仍然是现代实验室使用的一项基本技术。大多数尖端生物学和生物医学研究均涉及核酸样本的实验技术和工作流程，例如PCR、qPCR、二代测序、克隆等实验技术要求研究人员在下游实验中使用核酸样品之前，必须确定样品纯度以及其他影响核酸样品的重要变量。

酚氯仿抽提法是经典的DNA提取方法，若操作不当会导致苯酚残留在DNA样品中，所以开展下游实验之前，确定核酸样品的浓度、纯度和质量是非常重要的。

Acclaro智能污染物分析技术

纯度比一直是评估紫外吸收污染物存在的主要方法，通常研究人员会评估其纯度比是否在可接受的范围内(表1)。

表1: TE缓冲液中纯核酸样品普遍接受的纯度比范围。请注意，纯苯酚的纯度比与纯核酸的纯度比相差不大。

然而，仅依靠纯度比并不能完全地评估核酸样品中潜在的污染物(例如苯酚)，NanoDrop One分光光度计中Acclaro智能污染物分析技术通过使用化学计量学方法分析样品中存在的化学成分，为污染物鉴定提供了一种前沿的定量方法。

图2: Acclaro污染物功能识别样品中可能存在的污染物。1A)测量屏幕:Acclaro污染物图标表示Acclaro算法在dsDNA样本中检测到潜在污染物。1B)污染物分析屏幕:对比原始吸收光谱(DNA +苯酚，蓝色)、校正光谱(已扣除污染物，绿色)和污染物光谱(橙色)。此屏幕还包含原始和校正的DNA浓度结果。

DNA样品中的酚污染实验

制备双链DNA溶液（鲑鱼精子DNA，浓度225ng/ul），用NanoDrop One分光光度计对TE空白测定原液的浓度，通过添加不同量的DNA和苯酚原液，制备了9种DNA和苯酚混合物，其混合物如表2所示。

表2: dsDNA和苯酚原液混合得到上述样品。

每种溶液在NanoDrop One仪器上对TE空白进行5次重复测量。每个重复使用新鲜的1.5μL合适的混合物。dsDNA应用程序计算浓度(原始-未校正和校正)并提供污染物识别数据，然后用于生成表3所示的数据

表3: 使用dsDNA应用NanoDrop One分光光度计测定每种混合物和仅DNA对照(混合物1)的DNA浓度。混合物3至9的校正DNA浓度直接从Acclaro污染物分析屏幕上获得。Acclaro污染物图标表示混合物的酚污染水平触发Acclaro的检测结果

表3给出了从表2中描述的9种DNA/苯酚混合物中获得的Acclaro污染物数据，请注意，苯酚成分是以百万分之一(ppm)表示的。

结果表明，当苯酚含量低至37.5ppm时，A260/280为1.83，A260/A230为2.32，纯度比值看起来非常优秀，但是表示样品污染的小旗帜标志已经显示出来，NanoDrop One鉴定出了苯酚的污染，并且对核酸浓度进行了校正，校正后的浓度为240.61ng/μL，接近真实浓度。1600ppm的苯酚污染使得传统方法给出的浓度值已经虚高到1041.5ng/μL，几乎是真实核酸浓度的4倍，而NanoDrop One鉴定出了苯酚的污染，并且对核酸浓度进行了校正，校正后的浓度为266.45ng/μL。传统方法只能给出纯度比值，并不能鉴定是何种污染物，也不能给出校正后的浓度。

当苯酚污染大于18.75 ppm时，Acclaro功能标记样品，具有高灵敏度。Acclaro智能污染物鉴定技术可以识别苯酚污染、正确校正浓度值以及提供比单独使用A260值更准确的浓度结果。

图3: 绘制了每种dsDNA/苯酚混合物的平均纯度比。其中红线为260/230纯度比，蓝线为260/280纯度比。

图3的图表表明，苯酚污染的增加对A260/280和A260/230比值的影响都非常小。苯酚污染600 ppm的DNA样本，其A260/280比值为1.71，A260/230比值为2.08；这些值在一般接受的纯核酸样品的范围内。然而，在这种苯酚污染水平下，DNA浓度的结果通常相差两倍以上。

传统上，研究人员依赖A260/280和A260/230比值作为核酸溶液中污染物存在的指示。虽然纯度比可以指示某些污染物的存在，但它们不能鉴定污染物信息和浓度。

NanoDrop One分光光度计内置的Acclaro样品智能技术为使用紫外光谱分析进行污染物识别提供了一种化学计量方法：

• 准确识别存在于核酸样品中的酚污染

• 准确计算苯酚污染量

• 提供比单独使用260 nm吸光度更准确的校正DNA浓度值

产品专员

基因有限公司作为Thermo的忠实合作伙伴，在国内推广NanoDrop产品线近20年，在全国19个大中城市设有办事处或者联络点，接下来也将会一如既往地继续为广大客户提供包括NanoDrop在内的产品售前咨询、售后支持和仪器维护维修等优质服务。