有望彻底改变RNA研究的测序试剂盒

【字体：大中小】 时间：2023年12月14日 来源：PacBio

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　　在这篇博文中，我们将简要介绍使用PacBio HiFi测序的全长RNA-seq的历史，回顾以前的吞吐量限制，以及最近推出的Kinnex全长RNA试剂盒带来的突破性承诺。

RNA测序(RNA-seq)已经成为分析生命所有领域转录组的不可或缺的工具，可以揭示生物学和疾病的见解。虽然大多数物种的基因组在短时间内保持相对稳定，但转录组——表达的信使RNA (mRNA)转录的总和——会因许多因素而变化，包括发育阶段、生态条件和疾病。然而，当涉及到RNA测序时，并不是所有的测序技术都是平等的。

同种异构体，而不是基因，才是生物学和疾病的驱动因素

有时科学挑战需要创新技术来带来新的发现。使用PacBio HiFi的长读RNA测序(称为Iso-Seq方法)与传统的短读RNA测序有很大不同。PacBio的Iso-Seq方法不是将全长cDNA(可达数十个碱基)分割成100-200 bp的短片段，然后进行计算组装，而是对整个全长分子进行测序;不需要组装。

Iso-Seq方法是有利的，因为在真核生物物种中选择性剪接可以从同一基因产生多个复杂的信使rna(又称同种异构体)。不同的同工异构体可以翻译成不同的蛋白质，这些蛋白质具有不同的，和有时反对,的功能。因此，通过RNA测序对生物学和疾病的研究必须对同工异构体景观有一个精确和严格的看法。短读RNA-seq通常不能明确地解决复杂的选择性剪接事件，而Iso-Seq方法能够清楚地揭示它们，而不需要任何相同的计算挑战。

Iso-Seq方法带来了广泛的发现。在植物和动物科学中，Iso-Seq使研究人员能够产生高质量的基因组注释，并对农业上重要的作物、濒危物种、模式生物和进化上独特的物种进行转录表达分析。在人类遗传学中，Iso-Seq使科学家能够阐明罕见疾病，区分医学上重要的假基因，创建更好的细胞图谱，并识别作为潜在癌症疫苗候选物的新抗原。

通过Kinnex打破吞吐量障碍

虽然Iso-Seq已经在植物和动物以及人类遗传学研究中确立了其临界值，但其相对较低的通量可能会阻碍大规模的群体水平RNA实验，而这些实验可能会揭示重要的同种异构体驱动的见解。Sequel II系统上一个SMRT Cell 8M上的典型的Iso-Seq文库产生大约400万reads，这足以用于异构体发现和基因组注释，但难以扩展到大量样本。

新的Kinnex套件现在打破了这一障碍。
在ASHG 2023上，三款涵盖三个关键应用的Kinnex套件向全球发布。用于大容量RNA测序的Kinnex全长RNA试剂盒现在使用户能够在Sequel II上每个SMRT细胞分别产生1500万reads和在Revio系统上每个SMRT细胞分别产生4000万reads。这代表了吞吐量增加16倍当使用Kinnex时，在Revio上进行RNA测序。由于Revio系统为用户提供了同时运行4个SMRT细胞的灵活性，因此测序时间也大大减少。

为了说明这一巨大的转变，PacBio和合作者团队使用11个Revio SMRT细胞生成了一个WTC-11细胞系数据集，在短短三天内总计读取了大约6亿次。要在Revio系统发布之前生成等量的数据，并且没有Kinnex套件，它将需要150个SMRT细胞和38周的运行时间!

最重要的是，这种巨大的通量增加不会损害原始样品中发现的RNA转录物长度或相关丰度。Kinnex为用户提供了同样的研究优势，提供了长，准确，完整的转录信息-现在可以在更短的时间内进行超过数量级的读取。

并不是所有的读都是相等的

在“读”级别，相应的Kinnex和短读数据在吞吐量方面似乎是可比较的。但在“碱基对”层面，Kinnex为用户提供了10倍以上的数据访问!这是因为每个Kinnex reads代表一个全长cDNA分子，其长度范围从几百个碱基到超过10kb。相比之下，每个短读段只有150 bp长，只能部分覆盖每个全长转录本。这意味着短读RNA-seq用户必须承担计算转录本组装的繁琐任务，这一过程已被反复证明会导致转录本同工型的不准确估计。

与其他长读测序技术相比，PacBio HiFi以其准确性脱颖而出。LRGASP(长读RNA-seq基因组注释评估项目)联盟旨在系统评估不同长读RNA-seq文库制备和分析工具的性能。尽管与“纸上”的牛津纳米孔(ONT)数据相比，其读取次数少了10倍，但该联盟发现PacBio的Iso-Seq数据检测到的基因数量最多。

SMRT Link:通过整合广泛采用的社区工具，简化了全长转录本分析

新的数据类型通常伴随着新的计算挑战。在长读RNA-seq的早期，用户经常发现缺乏分析工具。从基于短读的工具移植过来的解决方案包含许多关于数据碎片性的残余假设，并且不能利用Iso-Seq数据是全长的事实。然而，多年来，PacBio的科学家和长读用户社区都开发了一套不断增长的专用长读工具，用于转录本分类、基因组注释、定量分析、融合调用等等。

用于运行PacBio长读测序仪器的软件SMRT Link现在为用户提供了许多内置的分析功能。从与新Kinnex试剂盒同时发布的13.0版本开始，全长转录本分析在简化的按钮工作流程中支持批量RNA测序。SMRT Link中的“Read Segmentation and Iso-Seq”分析选项采用从Kinnex全长RNA库生成的HiFi reads，并产生具有分类和丰度信息的高质量全长同种异构体。转录本分类能力的核心是pigeon，它是对SQANTI3的PacBio改编，它已经成为根据已知参考注释对转录本同种异构体进行分类的最流行和公认的标准之一。

SMRT Link 13.0只是一个开始。有关更多用于下游RNA分析的PacBio兼容工具的策划列表，请阅读我们的生物信息学应用简介。

今天就开始明天的发现

随着RNA测序的不断发展，Kinnex成为一股革命性的力量，使研究人员能够突破障碍，迎来一个充满可能性的新时代。通过提供前所未有的通量的更完整的同种异构体视图，Kinnex体现了PacBio对推进转录组学的承诺。最近推出的Kinnex试剂盒使HiFi测序用户能够在不影响数据质量的情况下产生16倍以上的读数，从而改变RNA实验的可能性。

RNA-seq的未来就在眼前，有了Kinnex，研究人员今天就可以开始进行RNA的未来发现。如果你从事转录组学研究，现在是时候加入RNA革命了!